胶质母细胞瘤中PD-L1自调控机制通过GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/IL6信号通路促进肿瘤恶性进展

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)对PD-1/PD-L1抑制剂疗法反应不佳的临床难题，揭示了PD-L1通过自调控机制激活GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/NFκB/IL6信号通路的新机制。研究发现PD-L1与GP130和PD-1相互作用，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，同时STAT3转录上调PD-L1表达形成正反馈循环。该研究为开发双特异性抗体anti-IL6×PD-L1联合治疗策略提供了理论基础，对改善GBM免疫治疗疗效具有重要意义。

　　

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)作为最具侵袭性的脑癌，患者中位生存期仅约14个月，尽管癌症治疗取得了显著进展，但免疫治疗却收效甚微。这种困境主要源于GBM存在高度免疫抑制的微环境，其中程序性死亡配体1(PD-L1)的高表达与患者不良预后密切相关。然而，PD-L1/程序性死亡受体1(PD-1)阻断疗法在大多数临床试验中对GBM患者几乎无效，这促使研究人员迫切需要探索GBM细胞内在免疫抑制微环境的形成机制。

以往研究表明，GBM细胞通过多种免疫检查点和免疫抑制性细胞因子促进免疫抑制状态，但PD-L1在GBM细胞中如何介导免疫抑制微环境的具体机制尚不清楚。特别是抗PD-L1/PD1单药治疗在NCT03750071、NCT03047473和NCT03233152等临床试验中显示有限疗效，表明癌细胞表达的某些因子抑制了PD-L1/PD-1阻断疗法的效果。因此，深入了解GBM细胞中PD-L1信号传导及介导PD-L1表达的因素，对于开发有效的PD-L1/PD-1阻断疗法具有重要价值。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，中国研究团队揭示了PD-L1自调控促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的新机制。研究人员发现PD-L1通过与GP130和PD-1相互作用，激活GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/NFκB/IL6信号通路，而STAT3又转录促进PD-L1表达，形成正反馈循环。该研究不仅阐明了PD-L1在GBM进展中的重要作用，还为开发靶向PD-L1信号传导的双特异性抗体治疗策略提供了新思路。

研究人员运用了多个关键技术方法：利用TCGA-GBM数据集进行生物信息学分析；采用免疫组织化学(IHC)检测80例人原代GBM石蜡样本和20例癌旁组织；通过蛋白质印迹(Western blot)分析蛋白表达；使用细胞热转移分析(CETSA)和免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白相互作用；进行细胞活力(CCK8)、集落形成、EdU掺入、Transwell和伤口愈合实验评估细胞表型；采用双荧光素酶报告基因检测转录活性；通过分子对接分析蛋白质相互作用界面。

PD-L1在GBM中高表达且与患者不良预后相关

研究发现PD-L1 RNA在GBM组织中显著升高，GBM患者血清PD-L1水平显著高于健康对照组。蛋白质水平分析显示，与人星形胶质细胞系HA1800相比，GBM细胞系T98和U87中PD-L1蛋白表达显著上调。免疫组化染色证实PD-L1在GBM组织中高表达，且PD-L1 IHC免疫反应评分(IRS)的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.9234，表明PD-L1 RNA在区分健康对照和GBM方面具有高度能力。生存分析显示，PD-L1高表达的GBM患者总生存期和无病生存期更差。

PD-L1促进GBM细胞活力、增殖、迁移和侵袭

通过沉默PD-L1表达，研究人员发现敲低PD-L1显著降低了GBM细胞活力、细胞增殖(集落形成和EdU掺入实验)、细胞迁移、细胞侵袭和伤口愈合能力。这些结果表明PD-L1表达促进了GBM细胞的恶性表型。

PD-L1通过相互作用激活GP130/JAK2/STAT3信号通路

相关性分析显示PD-L1与GP130、JAK2和STAT3呈正相关。分子对接分析表明PD-L1与GP130结合自由能为-45.21 kcal/mol，主要与GP130的D2和D3结构域(细胞因子结合模块)相互作用。CETSA实验显示重组PD-L1(rPD-L1)处理延迟了GP130降解，表明PD-L1确实与GP130结合。Co-IP实验证实PD-L1与GP130和PD-1在GBM细胞中相互作用，GP130也与PD-L1和PD-1相互作用。免疫荧光染色显示PD-L1与GP130的部分共定位发生在细胞膜周围，但大部分共定位发生在细胞质中。沉默PD-L1显著下调了GP130、磷酸化JAK2(P-JAK2)和磷酸化STAT3(P-STAT3)的表达。此外，来自GBM细胞的上清液激活了THP1细胞中的GP130/JAK2/STAT3，而沉默PD-L1显著减弱了这种激活作用。

PD-L1依赖STAT3促进GBM细胞恶性表型

STAT3在GBM细胞中高度活化。挽救实验表明，在沉默PD-L1的GBM细胞中过表达STAT3，可恢复细胞活力、增殖、迁移、侵袭以及伤口愈合能力，表明PD-L1通过STAT3介导GBM细胞的恶性行为。

STAT3通过IRAK2/NFκB/IL6信号通路促进GBM进展

生物信息学分析发现IRAK2与STAT3高度相关(Pearson R=0.74)。STAT3在IRAK2启动子区域有5个潜在结合位点，其中E5框包含STAT转录因子特异性的γ-激活序列(GAS)元件。双荧光素酶报告基因实验证实STAT3能够结合IRAK2启动子。沉默STAT3下调了IRAK2表达，同时STAT3也被证明能够转录调控PD-L1表达。STAT3在PD-L1启动子区域有多个潜在结合位点，染色质免疫沉淀(ChIP)测序数据显示活性组蛋白标记(H3K4me3、H3K27Ac)和STAT3 ChIP峰在PD-L1启动子区域富集，双荧光素酶报告基因实验证实STAT3能够结合PD-L1启动子。IRAK2与白细胞介素6受体(IL6R)和IL6呈正相关，沉默IRAK2抑制了NF-κB p65(P65)活性和IL6表达，降低了GBM细胞活力、集落形成、增殖、迁移、侵袭和伤口愈合能力。

STAT3依赖IRAK2介导GBM细胞恶性表型

挽救实验显示，在STAT3沉默的GBM细胞中过表达IRAK2，可恢复IRAK2表达和GBM细胞活力、集落形成、增殖、迁移、侵袭以及伤口愈合能力，表明STAT3通过IRAK2促进GBM进展。

PD-L1调控的IL6与免疫抑制微环境相关

沉默PD-L1显著下调了IRAK2、磷酸化NF-κB p65(P-P65)和IL6表达。免疫组化分析显示，在人GBM组织中，PD-L1高表达伴随着P-JAK2、P-STAT3、IRAK2和IL6的表达升高，这些分子的IHC评分呈正相关。生物信息学分析表明，IL6 RNA表达不仅与巨噬细胞相关基因CXCL1、CXCL2、CXCL12、CCL2、CCL20、TGFβ(已知在GBM中促进髓源性抑制细胞(MDSC)扩增和功能)呈正相关，还与IL10、EGF、TGFβ、LOX和SPP1以及巨噬细胞标志物(已知促进GBM中巨噬细胞浸润)呈正相关。此外，IL6与S100A8、S100A9、CXCL1和CXCL8(据报道在GBM中抑制树突状细胞)呈正相关，表明PD-L1介导的IL6通过参与MDSC、GBM相关巨噬细胞和树突状细胞抑制与GBM免疫抑制相关。

本研究的重要结论在于揭示了PD-L1通过自调控机制促进GBM细胞增殖、迁移和侵袭的完整信号通路。研究人员发现PD-L1通过与GP130和PD-1相互作用，激活GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/NFκB/IL6轴，而STAT3又转录促进PD-L1和IRAK2表达，形成PD-L1/GP130/JAK2/STAT3/PD-L1和PD-L1/GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/NFκB/IL6/GP130/STAT3/PD-L1两个正反馈循环。

讨论部分强调，这一发现解释了为什么PD-L1和IL6在GBM中持续高表达并构成免疫抑制微环境。首先，PD-L1表达可通过Toll样受体(TLR)、表皮生长因子(EGFR)、干扰素α受体(IFNAR)和干扰素γ受体(IFNGR)等多个激活途径被促进，而本研究发现的PD-L1自调控机制为其持续高表达提供了新解释。其次，PD-L1和IL6均能激活GP130/JAK2/STAT3通路，STAT3可促进GBM细胞中PD-L1表达，GBM来源的IL6以STAT3依赖性方式促进外周免疫抑制性髓系细胞PD-L1表达。第三，STAT3是促进GBM免疫抑制的主要因子，PD-L1介导的IL6与MDSC、GBM相关巨噬细胞和树突状细胞抑制呈正相关，这些细胞已知在GBM中形成免疫抑制。

该研究的重要意义在于提出了靶向PD-L1~IL6环路可能是GBM治疗的有前景策略。鉴于PD-L1和IL6都能触发STAT3活性(STAT3是促进GBM免疫抑制的中心枢纽)，研究人员建议开发双特异性抗体anti-IL6×PD-L1作为GBM治疗的选择。虽然研究存在一些局限性，如未阐明胞质中PD-L1-GP130相互作用的作用、未检测原代GBM样本中的免疫抑制相关标志物、未在体内检查同时靶向PD-L1和IL6对GBM免疫微环境的影响，但研究结果明确表明PD-L1/GP130/JAK2/STAT3/IRAK2/IL6与GBM临床相关，为改善GBM免疫治疗疗效提供了新的理论基础和治疗策略。