空间转录组学揭示IL-17信号通路在艰难梭菌感染小鼠模型中的促炎作用及层特异性基因表达差异

本期推荐一项利用空间转录组学技术探究艰难梭菌感染（CDI）病理机制的研究。该研究通过比较有症状与无症状感染小鼠的肠黏膜基因表达差异，发现IL-17信号通路及其下游NF-κB和MAPK通路显著激活，并首次揭示了肠道浅层与深层黏膜在基因表达上的层特异性差异，为CDI的靶向治疗提供了新思路。

　　

在当前医疗环境中，抗生素相关性腹泻和医院内感染已成为严峻的公共卫生挑战，而艰难梭菌（Clostridioides difficile）正是其中最常见的病原体之一。这种革兰阳性厌氧菌能够产生两种强效外毒素TcdA和TcdB，通过破坏宿主细胞内的肌动蛋白细胞骨架和紧密连接，导致肠上皮屏障功能丧失、细胞死亡，并引发剧烈的炎症反应。尽管目前有万古霉素和非达霉素等抗生素被推荐用于治疗，但疗效不尽人意且复发率高，这使得深入研究CDI的发病机制显得尤为迫切。

值得注意的是，在实验感染模型中，约有30%的小鼠即使暴露于标准剂量的产毒艰难梭菌菌株，仍表现为无症状携带状态，这为研究宿主因素在疾病发生中的作用提供了独特视角。为了解决这一科学问题，Purdue大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，利用前沿的空间转录组学技术，首次在组织原位层面揭示了有症状与无症状感染小鼠肠道黏膜的基因表达差异，并发现了不同黏膜层的特异性反应模式。

研究团队主要采用了NanoString GeoMx空间转录组学平台对FFPE肠组织切片进行分析，结合免疫荧光染色（使用抗PanCK、抗CD45和抗CD3抗体）区分不同细胞类型和区域，通过Illumina NextSeq2000进行测序，并利用qPCR对关键差异表达基因进行验证。所有动物实验均遵循AVMA指南并经Purdue大学IACUC批准（协议号2008002068），使用C57BL/6小鼠建立CDI模型。

选择有症状与无症状小鼠的感兴趣区域（ROIs）

通过H&E、PanCK和CD45染色，研究团队从有症状和无症状小鼠的结肠和盲肠浅层及深层区域选择了25个ROIs。有症状小鼠表现出明显的水肿、中性粒细胞驱动的炎症、坏死和溃疡，而无症状小鼠的组织形态与未感染对照组相似。CD45染色成功标记了免疫细胞浸润区域，为后续空间转录组分析提供了基础。

热图与聚类分析结果

聚类分析热图显示，有症状小鼠中多个炎症相关基因显著上调，包括Lcn2、Dusp1、Cxcl2、S100a8、S100a9、Defa2、Gstm1、H3c2、H4c17、Cd74和B2m。这些基因的表达模式明显区分了有症状与无症状小鼠，以及肠道不同层次的变化。

空间转录组学分析

有症状与无症状小鼠的差异转录组分析

比较有症状与无症状小鼠所有肠道层次（浅层、中层和深层）的基因表达，发现13,801个基因存在差异表达。其中227个基因在有症状小鼠中上调至少两倍（Log2FC≥1），173个基因下调至少两倍（Log2FC≤-1）。IL-17信号通路是最显著上调的炎症通路之一，并激活了下游的NF-κB和MAPK通路（包括Cd14、Jun、Areg、Dusp1、Mapk8、Tlr4、Nfkbia和Il1b等基因）。

关键上调基因包括S100a8（LFC=3.13）、S100a9（LFC=2.55）、Lcn2（LFC=3.56）、Cxcl2（LFC=2.67）和Dusp1（LFC=3.4），这些基因均与IL-17信号通路和中性粒细胞招募相关。而下调基因主要涉及抗原处理与呈递（如Cd74、Ctss、Psme2和B2m）、代谢途径（如Fabp6、Fads2、Hao2和Gstm1）和中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成（如H3c2和H4c17）。防御素家族基因（Defa2、Defa17等）也显著下调，表明天然免疫防御功能受损。

有症状与无症状小鼠肠道浅层与深层差异基因表达

研究发现肠道不同层次的基因表达存在显著差异。S100a8和S100a9在浅层表达更高（LFC=3.30和3.26），而Lcn2在深层表达更显著（LFC=4.44）。Cd74在浅层和深层均显著下调（LFC=-3.81和-4.04），Gstm1在深层下调更明显（LFC=-3.23），B2m在浅层下调更显著（LFC=-1.76）。组蛋白基因H3c2和H4c17在浅层显著下调，但在深层变化不明显甚至略有上升。

有症状小鼠肠道层次间差异基因表达

比较有症状小鼠浅层与深层黏膜，发现4,012个基因上调，739个基因下调。S100a8和S100a9层次间无显著变化，Lcn2在深层表达更高（LFC=-1.32），Cd74和Gstm1在浅层表达更高（LFC=0.63和1.52），而H3c2和H4c17在浅层显著下调（LFC=-4.00和-3.37）。

无症状小鼠肠道层次间差异基因表达

在无症状小鼠中，Cd74、Gstm1、H3c2和H4c17等基因在浅层相比深层显著下调（LFC=-1.10、-1.50、-1.42和-1.52），表明即使在没有症状的情况下，肠道不同层次的基因表达也存在固有差异。

qPCR验证空间转录组结果

通过qPCR对结肠组织样本进行验证，确认了S100a8、S100a9、Lcn2、Cxcl2和Dusp1在有症状小鼠中显著上调，而Cd74显著下调（p<0.01），与空间转录组结果高度一致。

通路分析

通路分析显示，有症状小鼠中Toll样受体、C型凝集素受体（CLRs）、IL-1和IL-17等促炎通路显著上调。IL-17信号通路覆盖了100%的相关基因，且激活了下游的MAPK（80%覆盖率）和NF-κB（98.55%覆盖率）通路。相反，抗原处理与呈递、脂质和氨基酸代谢以及PPAR信号通路等则显著下调。

这项研究通过空间转录组学技术揭示了CDI中宿主反应的复杂调控网络。研究发现有症状小鼠表现出强烈的IL-17信号通路激活，并伴随NF-κB和MAPK通路的上调，这解释了临床观察到的严重炎症和组织损伤。值得注意的是，研究首次发现了肠道浅层与深层黏膜在基因表达上的层特异性差异：浅层黏膜主要表现为前线免疫防御功能（如S100a8/S100a9和Cxcl2高表达），而深层黏膜则侧重于抗菌防御（如Lcn2高表达）。

研究还发现多个免疫相关基因（Cd74、B2m）和抗氧化基因（Gstm1）的下调，以及组蛋白基因（H3c2、H4c17）的表达减少，这些变化共同导致抗原呈递功能受损、氧化应激增加和NET形成能力下降，从而加剧了感染严重程度。这些发现不仅深化了对CDI发病机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了方向：针对IL-17信号通路特定组分（如Traf6）的干预可能在不影响整个通路功能的情况下减轻炎症反应；而增强Cd74、B2m和Gstm1表达可能改善免疫识别和抗氧化防御能力。

该研究的层特异性分析为未来开发靶向特定肠道层次的精准治疗策略奠定了基础，空间转录组学技术的应用也为研究其他肠道疾病的病理机制提供了新范式。尽管样本量有限且取样时间点存在差异，但通过qPCR验证和多次独立实验，研究结果保持了高度可靠性，为CDI的临床管理和治疗创新提供了重要科学依据。