NSUN7介导NLRP3 m5C甲基化促进多囊卵巢综合征颗粒细胞焦亡的作用机制研究

本研究针对多囊卵巢综合征(PCOS)中颗粒细胞焦亡的调控机制展开探索。研究人员通过临床样本分析、体外细胞模型和动物实验证实，RNA甲基转移酶NSUN7通过介导NLRP3基因m5C甲基化修饰增强其mRNA稳定性，从而促进caspase-1/GSDMD通路介导的细胞焦亡进程。该发现揭示了NSUN7-m5C-NLRP3轴在PCOS发病中的关键作用，为疾病诊断和治疗提供了新的表观遗传学靶点。

　　

多囊卵巢综合征(PCOS)作为影响育龄妇女最常见的内分泌疾病，全球发病率高达4%-18%，近年来在中国的发病率也呈现持续上升趋势。该疾病以高雄激素血症、排卵功能障碍、多囊卵巢形态和代谢异常为主要特征，其诊断困难和治疗手段的非特异性仍是临床面临的重要挑战。尽管研究不断深入，PCOS的发病机制仍然不明，可能涉及复杂的遗传-环境-生活方式相互作用。近年来研究发现，细胞焦亡(pyroptosis)——一种不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡形式，在PCOS病理生理过程中可能发挥关键作用。这种炎症性细胞死亡由炎症小体(inflammasome)激活所介导，导致caspase处理加工和gasdermin D(GSDMD)裂解，诱导细胞膜破裂和促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的分泌。由于炎症与PCOS密切相关，这种炎症性细胞死亡形式在PCOS研究中受到越来越多关注，然而其调控机制仍不清楚。

表观遗传修饰在PCOS发展中的作用日益受到重视，特别是在颗粒细胞中。5-甲基胞嘧啶(m⁵C)甲基化是一种RNA修饰，通过影响mRNA稳定性、剪接和翻译参与疾病进程。NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员7(NSUN7)是一种RNA甲基转移酶，催化甲基转移到胞嘧啶碳5位置。虽然NSUN7被认为是精子运动调节器，最近研究表明它可能参与人类疾病，但NSUN7在卵巢生理学和PCOS发病机制中的作用尚不清楚。

本研究旨在探讨NSUN7在卵巢颗粒细胞焦亡调控中的作用及其对PCOS发病的潜在贡献。研究人员假设NSUN7介导的NLRP3 m⁵C甲基化参与PCOS进展。该研究确定了NSUN7介导的NLRP3 m⁵C甲基化是PCOS中颗粒细胞焦亡的新型表观遗传调控机制，NSUN7-NLRP3轴可能成为PCOS的新治疗靶点。该研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上。

研究人员综合运用了生物信息学分析、临床样本检测、细胞培养与转染、功能实验（CCK-8、ELISA、流式细胞术、Western blotting）、分子机制研究（MeRIP-PCR、RIP-qPCR、双荧光素酶报告实验、放线菌素D处理）以及动物模型验证等多种技术方法。临床样本来自40例PCOS患者和40例健康对照，动物实验使用SD大鼠建立letrozole诱导的PCOS模型，通过卵巢内注射慢病毒进行基因干预。

NSUN7表达在PCOS中上调

为识别可能参与PCOS进展的基因，研究人员使用微阵列筛选PCOS与健康对照之间的差异表达基因(DEGs)。在PCOS中预测到多个上调或下调基因。m⁵C修饰已被报道与疾病进展相关，然而m⁵C在PCOS中的作用仍不清楚。NSUN7作为m⁵C写入器，在PCOS中表达上调，因此被选为研究对象。LPS处理的KGN细胞中NSUN7表达增加。此外，从PCOS患者和正常个体获取颗粒细胞，检测NSUN7表达。结果显示，PCOS组NSUN7表达高于正常组。NSUN7的诊断价值通过ROC曲线评估，曲线下面积(AUC)值为0.9853，表明NSUN7是潜在的诊断生物标志物。PCOS患者颗粒细胞中NSUN7蛋白水平高于正常组。总之，NSUN7是PCOS中上调的基因，可能参与PCOS进展。

NSUN7敲低减轻LPS诱导的焦亡

为分析NSUN7的作用，通过转染shNSUN7至KGN细胞敲低NSUN7表达。与shNC转染相比，shNUSN7转染后NSUN7水平降低。LPS处理抑制细胞活力，而NSUN7敲低逆转了这种抑制。进一步评估焦亡发现，LPS处理后IL-18和IL-1β水平增加，干扰NSUN7可挽救这一现象。LPS增加了焦亡率，沉默NSUN7抵消了细胞焦亡的促进作用。此外，在LPS诱导的KGN细胞中，敲低NSUN7下调了NLRP3、cleaved caspase1和GSDMD-N的蛋白水平，但不改变pro-caspase1和GSDMD蛋白水平。总之，干扰NSUN7抑制LPS刺激的KGN细胞焦亡。

NSUN7通过促进m⁵C甲基化稳定NLRP3

基于NSUN7对m⁵C甲基化的催化作用，评估了几个焦亡相关因子的m⁵C水平。沉默NSUN7降低了NLRP3的m⁵C水平，但不影响caspase1、ASC和GSDMD的m⁵C水平。RIP-qPCR结果显示NSUN7与NLRP3相互作用。通过生物信息学分析预测潜在的m⁵C位点，NLRP3中存在三个可能位点。双荧光素酶报告分析验证修饰位点，敲低NSUN7降低了与MUT-site 1和MUT-site 2共转染时的荧光素酶活性，但不影响与MUT-site 3共转染时的活性，表明位点1（位置56）和位点2（位置1061）是NLRP3中的m⁵C位点。稳定性实验显示NSUN7敲低降低了NLRP3 RNA稳定性。总之，NSUN7促进NLRP3的m⁵C甲基化，从而增强NLRP3稳定性。

NLRP3过表达消除了NSUN7下调引起的焦亡抑制

通过救援实验评估NSUN7和NLRP3对焦亡的影响。过表达质粒转染后NLRP3过表达。在NSUN7敲低的LPS诱导细胞中，NLRP3过表达抑制细胞活力，降低IL-18和IL-1β水平，并降低焦亡率。此外，干扰NSUN7引起的NLRP3、cleaved caspase1和GSDMD-N水平下调被NLRP3过表达逆转。数据表明，敲低NSUN7通过降低NLRP3表达抑制焦亡。

干扰NSUN7通过抑制颗粒细胞焦亡减轻体内PCOS

为确定NSUN7在PCOS中的作用，建立PCOS大鼠模型，并向卵巢注射Lv-shNSUN7。与对照组相比，PCOS大鼠动情周期紊乱。沉默NSUN7改善了模型组大鼠紊乱的动情周期。检测多种激素水平发现，PCOS大鼠FSH水平降低，而LH水平、LH/FSH比率和睾酮水平升高。敲低NSUN7逆转了PCOS大鼠的激素变化。卵巢形态学结果显示PCOS大鼠卵巢增大，而敲低NSUN7减少了卵巢直径。H&E染色观察大鼠卵巢病理变化，对照组大鼠卵巢形态正常，颗粒细胞排列整齐，可见卵泡和黄体。模型组大鼠呈现多囊卵巢，伴有卵泡闭锁和颗粒细胞排列紊乱。然而，敲低NSUN7在一定程度上改善了PCOS大鼠的这些不良变化。随后评估卵巢中的焦亡情况，IL-18和IL-1β浓度增加，NSUN7敲低抵消了这一现象。此外，PCOS大鼠NLRP3、cleaved caspase1和GSDMD-N蛋白水平上调，而沉默NSUN7逆转了letrozole引起的水平变化；然而，pro-caspase1和GSDMD水平未改变。随后从卵巢组织分离颗粒细胞，使用这些细胞评估焦亡。结果显示模型组IL-18和IL-1β水平增加，而敲低NSUN7后其水平降低。PCOS大鼠焦亡细胞率升高，NSUN7敲低抵消了这一现象。Western blotting结果显示，PCOS大鼠颗粒细胞中NLRP3、cleaved caspase1和GSDMD-N水平上调，而NSUN7敲低降低了PCOS模型中的水平；然而，letrozole和NSUN7不影响pro-caspase1和GSDMD水平。总之，敲低NSUN7通过抑制颗粒细胞焦亡改善PCOS中的激素异常。

研究结论与讨论部分指出，该研究为NSUN7在卵巢颗粒细胞焦亡调控和PCOS发病机制中的作用提供了新见解。结果表明敲低NSUN7抑制LPS诱导的KGN细胞焦亡，这一效应与NLRP3 m⁵C修饰减少和稳定性降低相关。此外，NSUN7敲低阻止了PCOS进展和体内焦亡。随着RNA修饰研究的深入，证据表明其在人类疾病包括PCOS中具有重要作用，特别是RNA修饰酶对疾病发展的调控。然而，目前PCOS中RNA修饰的研究仍处于初始阶段，m⁵C是否参与PCOS进展尚未明确。先前研究表明删除m⁵C写入器NSUN5可能阻碍卵泡发育导致卵巢功能不全。此外，m⁵C甲基化阅读器YBX1以m⁵C依赖性方式促进颗粒细胞增殖，从而参与卵巢功能不全。基于这些研究，研究人员假设m⁵C甲基化在伴有卵巢功能不全的PCOS中可能发挥重要作用。本研究发现另一个m⁵C写入器NSUN7在PCOS患者和LPS处理的KGN细胞中高表达。ROC曲线的AUC值0.9853证明了NSUN7的诊断价值。像其他m⁵C写入器一样，NSUN7被报道调控细胞功能。PCOS患者颗粒细胞焦亡增加，表明焦亡是PCOS的发病机制。因此，本研究通过鉴定细胞焦亡探索了NSUN7在PCOS中的作用。体外和动物研究结果表明敲低NSUN7通过抑制颗粒细胞焦亡抑制PCOS。这些数据将NSUN7定位为PCOS中卵巢颗粒细胞命运的关键调节器，填补了NSUN7对卵巢功能影响领域的空白。结果表明NSUN7可能是有前景的诊断生物标志物，靶向NSUN7是PCOS的潜在治疗策略。

阐明NSUN7在PCOS中的潜在机制十分迫切。鉴于NSUN7的m⁵C甲基化功能的重要性，NSUN7可能调控焦亡相关因子的m⁵C甲基化。结果表明沉默NSUN7抑制NLRP3而非其他焦亡相关因子的m⁵C甲基化。该研究揭示的NLRP3 m⁵C修饰发现了炎症小体的新型表观遗传机制。此外，由于m⁵C可调控RNA稳定性和翻译，探索了NLRP3的稳定性。数据显示NSUN7敲低抑制NLRP3稳定性。NLRP3等炎症小体是焦亡诱导因子，与多种炎症性疾病相关。慢性炎症是PCOS的特征。因此，异常NLRP3及随后焦亡有助于PCOS发病。抑制NLRP3激活和焦亡被认为是有前景的治疗策略。值得注意的是，Liu等人报道α-酮戊二酸抑制NLRP3依赖性KGN细胞焦亡。Xie等人揭示源自骨髓间充质干细胞的外泌体通过抑制NLRP3/caspase1通路抑制KGN细胞焦亡。这些研究证明了NLRP3在KGN细胞焦亡中的重要作用。本研究中，结果显示NLRP3过表达逆转了NSUN7敲低引起的焦亡抑制，表明NSUN7/m⁵C/NLRP3轴促进颗粒细胞焦亡。这些数据阐明了NSUN7功能的潜在分子机制，建立了线性因果关系。

该研究存在局限性。例如，PCOS是一种异质性疾病，本工作收集的临床样本可能未完全覆盖不同亚型。PCOS大鼠模型仅反映激素紊乱，不能完全重现人类PCOS。此外，本工作仅关注NSUN7/m⁵C/NLRP3轴对细胞焦亡的影响，但NSUN7对其他程序性细胞死亡模式的调控及其对其他RNA分子的修饰仍不清楚，需要进一步研究阐明其全局影响。

总之，该研究揭示了NSUN7在颗粒细胞焦亡调控和PCOS发病机制中的作用。结果表明干扰NSUN7通过抑制NLRP3 m⁵C甲基化抑制卵巢颗粒细胞焦亡，从而减轻PCOS诱导的激素异常。该工作为理解m⁵C修饰、焦亡和PCOS之间复杂相互作用开辟了新途径。此外，它突出了NSUN7作为PCOS新型治疗靶点的潜力。然而，将这些基础发现转化为临床实践面临重大挑战。未来研究人员将进一步探索NSUN7在多中心大样本PCOS人群中的诊断价值。此外，将专注于探索靶向NSUN7的小分子抑制剂或药物，比较其与现有药物的优缺点，并研究其在PCOS治疗中的安全性和有效性。