选择性HLA敲降与PD-L1表达可防止异体CAR-NK细胞排斥并增强异种移植小鼠的安全性和抗肿瘤反应

本刊推荐：为解决异体细胞免疫治疗中供体细胞被宿主免疫系统排斥的难题，研究人员开展了针对HLA（人类白细胞抗原）和免疫检查点（如PD-L1、HLA-E）的系统性研究。通过设计一种结合了选择性干扰HLA class I（但不影响HLA-E）的shRNA、嵌合抗原受体（CAR）和PD-L1或单链HLA-E（SCE）的单基因构建体，成功实现了异体CAR-NK细胞的一步法构建。这些细胞在体外和小鼠异种移植模型中均能有效逃逸宿主介导的排斥反应，并通过上调细胞毒性基因、减少耗竭表现增强抗肿瘤活性，同时因降低细胞因子释放综合征（CRS）相关炎症因子产生而展现出良好的安全性。该策略为“即用型”异体细胞免疫疗法提供了有前景的新方向。

　　

在癌症治疗领域，异体细胞免疫疗法展现出巨大的潜力，尤其是近年来靶向CD19和BCMA（B细胞成熟抗原）的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法相继获批，为血液恶性肿瘤患者带来了新的希望。然而，现有的CAR-T细胞疗法均使用患者自身的T细胞（自体来源），存在成本高昂、制备周期长（所谓“静脉到静脉时间”较长）以及细胞质量可能因肿瘤微环境的免疫抑制和既往化疗而受损等问题。利用健康供体的T细胞或NK细胞开发异体CAR细胞产品，虽可解决上述问题，但面临着宿主免疫系统对异体细胞的排斥以及异体CAR-T细胞可能引起移植物抗宿主病（GVHD）的巨大挑战。与T细胞不同，自然杀伤（NK）细胞不会介导GVHD，使其成为开发异体CAR疗法的理想候选者。早期临床试验表明，异体“即用型”脐带血（UCB）来源的CAR-NK细胞安全性良好且疗效可观。尽管如此，异体CAR-NK细胞仍能被受者的免疫系统识别并迅速排斥。

异体排斥主要由CD8⁺ T细胞通过T细胞受体（TCR）识别肽-主要组织相容性复合物（pMHC）所介导。为避免T细胞介导的排斥，标准方法是利用CRISPR基因编辑或shRNA干扰技术敲除或敲降抗原加工相关转运蛋白（TAP）或β₂-微球蛋白（B2M），从而广泛抑制MHC I类分子的表达。然而，这种普遍抑制也会影响非经典MHC I类分子（如HLA-E和HLA-G）的表达，导致异体NK细胞因缺乏NKG2A介导的抑制信号而变得对宿主NK细胞的杀伤敏感。因此，需要对异体NK细胞进行额外的修饰，以克服宿主NK细胞介导的排斥。

免疫检查点抑制剂的应用显著改善了癌症治疗。近年来，PD-L1、HLA-E和CD47等免疫检查点分子被过表达于免疫细胞和非免疫细胞，以在异体环境下防止其被排斥，延长过继转移后的存活时间。尽管PD-L1最为人所知的是作为T细胞的检查点，但它在活化的NK细胞中也会诱导表达，并与更好的肿瘤控制和迁移能力相关。HLA-E是抑制性受体NKG2A的配体，后者表达于NK细胞和部分CD8⁺ T细胞上，HLA-E/NKG2A轴在多种恶性肿瘤的免疫逃逸中发挥作用。CD47则主要是巨噬细胞的检查点，后者可通过吞噬作用介导异体排斥。然而，在敲除或敲降pMHC表达后，PD-L1、HLA-E和CD47的表达能否抑制异体CAR-NK细胞的排斥，尚未得到系统评估。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，由Fuguo Liu、Mubin Tarannum、Yingjie Zhao、Yiming J. Zhang、James Dongjoo Ham、Kewen Lei、Yuhao Qiang、Xingyu Deng、Maily Nguyen、Khanhlinh Dinh、Shaobo Yang、Alaa Kassim Ali、Toni K. Choueiri、Jerome Ritz、Rizwan Romee和Jianzhu Chen组成的研究团队，系统评估了联合抑制pMHC表达与外源表达PD-L1和/或HLA-E在克服异体CAR-NK细胞被宿主T细胞和NK细胞排斥中的作用。他们鉴定出一种shRNA，能特异性敲降人HLA-A、HLA-B和HLA-C（统称HLA-ABC）的表达，而不降低人HLA-E的表达，并证明HLA-ABC的敲降能显著削弱宿主CD8⁺ T细胞和NK细胞介导的排斥。将shRNA介导的HLA-ABC敲降与外源PD-L1和/或HLA-E表达相结合，能 dramatically（显著地）降低异体NK细胞在体外和体内被宿主免疫系统排斥的程度。更重要的是，他们将shRNA、PD-L1或单链HLA-E（SCE）以及CAR构建体整合到同一个慢病毒载体中，实现了异体CAR-NK细胞的一步法构建，无需进行多步遗传修饰。这些异体CAR-NK细胞能有效控制肿瘤生长，逃避宿主T细胞和NK细胞的排斥，并在体内表现出更好的安全性。出乎意料的是，外源PD-L1和HLA-E的表达显著增强了NK细胞和CAR-NK细胞的抗肿瘤活性，这可能是由于细胞耗竭减少以及细胞毒性和增殖相关基因的上调。研究者认为，该方法也可应用于其他异体细胞产品，有助于设计“即用型”异体疗法。

本研究运用的几个关键技术方法包括：1） 从健康供体外周血分离NK细胞并进行细胞因子诱导的记忆样（CIML）刺激和扩增；2） 设计并筛选特异性靶向HLA-ABC（而非HLA-E）的shRNA，并通过慢病毒转导在NK细胞中实现高效敲降；3） 构建并表达包含CAR、PD-L1或单链HLA-E（SCE）的慢病毒载体，用于一步法生成工程化NK细胞；4） 利用流式细胞术全面评估细胞表型、细胞杀伤、激活和耗竭标志物；5） 建立人源化异种移植小鼠模型（使用NSG MHC I/II DKO小鼠）来评估异体NK细胞的持久性、抗肿瘤效果及宿主免疫反应；6） 通过体外共培养实验量化宿主T细胞和NK细胞对异体NK细胞的杀伤；7） 采用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，探究工程化NK细胞功能变化的分子机制；8） 使用多重细胞因子检测平台分析细胞因子释放综合征（CRS）相关因子的表达水平。

Identification of a potent shRNA for specific knockdown of HLA-ABC without affecting HLA-E expression

研究人员首先致力于开发能够逃逸宿主T细胞、NK细胞和巨噬细胞排斥的异体CAR-NK细胞。他们采用了一种分层策略，首先开发shRNA以敲降HLA-ABC，目的是抑制T细胞介导的排斥，并易于将shRNA整合到同一个CAR慢病毒载体中，实现异体CAR-NK细胞的一步法构建。他们针对B2M、TAP1、TAP2的mRNA序列以及HLA-ABC重链设计了shRNA。为了确保shRNA能特异性靶向HLA-ABC而不影响HLA-E，他们比对了全球人群中119个最流行的经典HLA I类等位基因（包括38个HLA-A、56个HLA-B、25个HLA-C等位基因）以及两个非经典HLA-E等位基因（E01:01和E01:03）的编码序列。他们设计的shRNA与HLA-ABC等位基因的错配不超过一个核苷酸，但与HLA-E等位基因有两个核苷酸错配。通过构建表达这些shRNA的慢病毒载体并转导人Jurkat T细胞，他们在转导48小时后通过流式细胞术检测HLA-ABC的表达。在测试的shRNA中，针对HLA-ABC重链的shRNA#1和#2，以及针对B2M的shRNA#13和#14，在抑制表面HLA-ABC表达方面最为有效。这四种shRNA在来自四位供体的NK细胞中也能有效敲降表面HLA-ABC表达。由于高效力，shRNA#1和#13被用于后续研究。shRNA#1与流行的HLA-A02等位基因有一个核苷酸错配，与HLA-E等位基因有两个核苷酸错配。为了验证shRNA#1是否能有效敲降HLA-A02的表达，研究人员从HLA-A02供体分离NK细胞，用表达shRNA#1的慢病毒载体转导，并通过流式细胞术检测HLA-A02表达。与未转导的NK细胞相比，转导细胞中HLA-A02的表达降低了约13倍，表明尽管存在一个核苷酸错配，shRNA#1仍能有效敲降HLA-A02表达。研究人员还确定了shRNA#1是否会干扰HLA-E的表达。干扰素γ（IFNγ）处理能显著诱导Jurkat T细胞表达HLA-E（平均荧光强度MFI从510增加到980）。在Jurkat T细胞中表达shRNA#1并未显著降低IFNγ诱导的表面HLA-E表达，而靶向B2M的shRNA#13则完全抑制了IFNγ诱导的表面HLA-E表达。此外，研究人员构建了一种单链HLA-E（SCE），其中HLA-E*01:03重链、B2M和来自HLA-G前导序列的肽通过两个连接子连接成一个单一多肽。将表达SCE的慢病毒载体转导入K562细胞（一种不表达HLA-ABC和HLA-E的人淋巴母细胞系）后，能导致高水平的HLA-E表达，该表达不被shRNA#1降低，但被shRNA#13降低。这些结果表明，shRNA#1和#13能有效敲降表面HLA-ABC表达，并且shRNA#1能特异性敲降表面HLA-ABC表达而不影响HLA-E表达。

HLA-ABC-reduced allogeneic NK cells can evade killing by host CD8⁺ T cells

研究人员研究了表面HLA-ABC降低的异体NK细胞是否能逃逸宿主CD8⁺ T细胞和NK细胞的杀伤。纯化的NK细胞用表达shRNA#1或shRNA#13的慢病毒载体转导，通过细胞分选（基于降低的HLA-ABC表达）纯化HLA-ABC降低的NK细胞，扩增后用作宿主CD8⁺ T细胞和NK细胞介导的杀伤的靶细胞。首先，来自HLA不匹配供体的CD8⁺ T细胞在IL-2存在下，用经丝裂霉素C预处理的异体NK细胞（具有正常HLA-ABC表达）预激7天。然后，将这些预激的CD8⁺ T细胞与预先标记的、具有正常或降低的HLA-ABC表达的异体NK细胞在效应靶比（E:T ratio）为0、1、10、20和50下共培养过夜，并通过流式细胞术测定异体NK细胞的裂解。结果显示，CD8⁺ T细胞以剂量依赖的方式杀伤具有正常HLA-ABC表达的异体NK细胞，在E:T比为50时达到80%的杀伤。相比之下，CD8⁺ T细胞对HLA-ABC表达降低的异体NK细胞的杀伤在E:T比为50时减少至约10%。预激的CD4⁺ T细胞对异体NK细胞没有明显的杀伤作用。为了测试表面HLA-ABC降低的异体NK细胞是否对宿主NK细胞的杀伤敏感，研究人员将NK细胞与预先标记的、具有正常或降低HLA-ABC表达的异体NK细胞在E:T比为0、5和10下共培养。由于NK细胞高表达CD47和SIRPα，其相互作用会抑制NK细胞杀伤，因此在共培养体系中加入了抗CD47抗体和人Fc受体（FcR）阻断抗体以抑制CD47-SIRPα轴和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。具有正常HLA-ABC表达的异体NK细胞未被明显杀伤，而HLA-ABC表达降低的异体NK细胞则以剂量依赖的方式被杀伤，在E:T比为10时达到约40%。总之，这些结果表明，通过shRNA#1和#13敲降异体人NK细胞中HLA-ABC的表达，能使它们逃逸CD8⁺ T细胞的杀伤，但当CD47-SIRPα相互作用被阻断时，会对NK细胞的杀伤敏感。

Exogenous expression of PD-L1 in allogeneic NK cells moderately inhibits host T cell responses

研究人员确定了PD-1-PD-L1相互作用对T细胞应答异体NK细胞的影响。NK细胞用表达PD-L1的慢病毒载体转导，通过细胞分选纯化PD-L1⁺ NK细胞并扩增。从外周血单核细胞（PBMC）中分离CD3⁺ T细胞，并与自体或异体NK细胞（有或无PD-L1表达）以1:1的比例共培养。共培养12小时后，通过流式细胞术测量T细胞的CD69和CD25表达。当T细胞与自体NK细胞（有或无外源PD-L1表达）共培养时，少于10%的T细胞表达CD69。当T细胞与无外源PD-L1表达的异体NK细胞共培养时，约40%的T细胞表达CD69。而当与表达外源PD-L1的异体NK细胞共养时，这一百分比降至约25%。类似地，与自体NK细胞共养时，少于3%的T细胞表达CD25；而与无外源PD-L1表达的异体NK细胞共养时，11%-15%的T细胞表达CD25；当与表达外源PD-L1的异体NK细胞共养时，这一百分比降至约7%。T细胞与自体NK细胞（有或无外源PD-L1表达）共养时未发生显著增殖，而与无PD-L1表达的异体NK细胞共养时，10-18%的T细胞发生了增殖；当与表达PD-L1的异体NK细胞共养时，这一百分比降至约7%。当预激的CD8⁺ T细胞在E:T比为10和20下与无外源PD-L1表达的异体NK细胞过夜共养时，分别约有40%和60%的未转导异体NK细胞被裂解，而表达PD-L1的异体NK细胞的裂解在E:T比为10和20时分别降至约30%和40%。总之，这些结果表明，在异体NK细胞上外源表达PD-L1能部分抑制宿主T细胞应答。

Exogenous expression of single-chain HLA-E inhibits the killing of allogeneic NK cells by host NK cells

NK细胞和一部分CD8⁺ T细胞表达CD94:NKG2A异源二聚体，它是HLA-E的受体。研究人员探究了异体NK细胞表达HLA-E是否能抑制宿主NK细胞的杀伤。他们采用了表达单链HLA-E（SCE）的策略，该策略最初用于在小鼠细胞中表达Qa-1^b（HLA-E的同源物），其中野生型（WT）重链的酪氨酸84被突变为丙氨酸（Y84A）或半胱氨酸（Y84C），以更好地使肽段适配肽结合沟。他们采用相同方法表达了三种形式的SCE，其包含来自HLA-G前导序列的肽（VMAPRTLFL）、B2M和HLA-E*01:03重链。用表达SCE变体的慢病毒载体转导K562细胞；所有三种SCE变体都支持表面HLA-E的表达，其中SCE Y84C在相同感染复数（MOI）下转导时显示最高表达水平。为了评估SCE变体的功能，将纯化的人NK细胞与有或无SCE表达的K562细胞共养。与亲本K562细胞共养后，约60%的NK细胞被诱导表达CD107a。与表达SCE WT、Y84A和Y84C变体的K562细胞共养后，这一百分比分别显著降低至约35%、30%和10%。类似地，与亲本K562细胞共养后，约40%的NK细胞为IFNγ⁺，而与表达SCE变体的K562细胞共养后，这一百分比显著降低至15-30%。NK细胞对K562细胞的杀伤被SCE变体的表达显著抑制，尤其是SCE Y84C（在E:T比为10时，裂解率从80%降至20%）。HLA-E呈递源自HLA-ABC和HLA-G重链前导序列的肽段。由于前导序列的氨基酸序列存在变异，研究人员测试了来自HLA-G的肽段以及来自13个流行HLA-ABC等位基因的6个肽段。K562细胞用表达呈现这些不同肽段的SCE Y84C的慢病毒载体转导，并在E:T比为0.5、1和3下与人NK细胞共养4小时。人NK细胞能有效裂解亲本K562细胞，在E:T比为3时达到约85%。表达呈现不同肽段的SCE Y84C均能显著抑制转导K562细胞的裂解，但呈现HLA-G肽段的SCE在抑制NK细胞裂解K562细胞方面最为有效。因此，呈现HLA-G肽段的SCE Y84C被用于所有后续研究。研究人员测试了SCE Y84C表达是否能保护HLA-ABC降低的异体NK细胞免受宿主NK细胞杀伤。他们使用shRNA#13来敲降HLA-ABC表达，因为它比shRNA#1更有效，能够进行更严格的杀伤试验。异体NK细胞用表达shRNA#13或shRNA#13加SCE Y84C的慢病毒载体转导，转导的NK细胞经分选纯化并扩增。来自五位健康供体的NK细胞在E:T比为0、5和10下（存在抗CD47和Fc阻断抗体的情况下）与具有正常或降低HLA-ABC表达的异体NK细胞，或降低HLA-ABC但外源表达SCE Y84C的异体NK细胞共养6小时。与具有正常HLA-ABC表达的异体NK细胞共养后，NK细胞未被诱导表达CD107a和IFNγ，但与HLA-ABC降低的NK细胞共养后，CD107a和IFNγ的表达被显著诱导。在HLA-ABC降低的NK细胞中外源表达SCE Y84C几乎完全抑制了共养后CD107a和IFNγ的诱导。类似地，NK细胞不杀伤具有正常HLA-ABC表达的异体NK细胞，但杀伤HLA-ABC降低的NK细胞，而这种清除被SCE Y84C的外源表达完全抑制。这些结果表明，外源表达SCE Y84C能抑制宿主NK细胞对HLA-ABC降低的异体NK细胞的杀伤。

HLA-ABC-reduced allogeneic NK cells with PD-L1 or SCE overexpression evade host immune cell killing in vitro

研究人员测试了联合HLA-ABC敲降与外源PD-L1和/或HLA-E表达是否能抑制异体NK细胞被宿主T细胞和NK细胞杀伤。异体NK细胞用表达shRNA#1、shRNA#13、SCE、PD-L1或各种组合的慢病毒载体转导，并验证了HLA-ABC的下调以及/或HLA-E或PD-L1的表达。转导的异体NK细胞经分选、扩增后用作靶细胞。宿主CD8⁺ T细胞用经丝裂霉素C预处理的未转导异体NK细胞（与NK细胞靶细胞来自同一供体）在IL-2存在下预激7天。然后将预激的CD8⁺ T细胞与标记的未转导（对照）或转导的异体NK细胞在E:T比为0、10和20下过夜共养。未转导的异体NK细胞被来自两位不同供体的CD8⁺ T细胞有效裂解，在E:T比为20时达到60%裂解。单独表达PD-L1或SCE仅部分抑制了CD8⁺ T细胞对异体NK细胞的杀伤，其中PD-L1比SCE更有效（40% vs 55%）。通过shRNA#1或#13敲降HLA-ABC显著降低了CD8⁺ T细胞对异体NK细胞的杀伤，在E:T比为20时降至约10%。联合HLA-ABC敲降和SCE表达能比单独HLA-ABC敲降进一步降低CD8⁺ T细胞对异体NK细胞的杀伤。在另一项使用来自四位健康供体的CD8⁺ T细胞的杀伤试验中，shRNA#1或shRNA#13介导的HLA-ABC敲降与SCE或PD-L1过表达的联合均能 dramatically 抑制CD8⁺ T细胞对异体NK细胞的杀伤，其中与PD-L1表达的联合效果优于与SCE表达的联合。因此，在体外，异体NK细胞中的HLA-ABC敲降对于逃逸宿主CD8⁺ T细胞杀伤最为重要，而PD-L1和/或SCE的过表达单独作用效果较差。类似地，宿主NK细胞在E:T比为0、5和10下（存在抗CD47和Fc阻断剂的情况下）与标记的未转导（对照）或转导的异体NK细胞共养6小时。未转导的或表达SCE和/或PD-L1的异体NK细胞未被宿主NK细胞杀伤。相反，通过shRNA#1或#13敲降HLA-ABC导致宿主NK细胞有效杀伤异体NK细胞，在E:T比为10时分别达到50%和60%。表达SCE（或加上PD-L1）完全消除了对HLA-ABC降低的异体NK细胞的杀伤，而表达PD-L1则不能。在另一项使用来自四位健康供体的NK细胞的杀伤试验中，表达SCE（而非PD-L1）完全抑制了对HLA-ABC降低的异体NK细胞的杀伤。研究人员还评估了HLA-ABC降低并过表达SCE Y84C和/或PD-L1的NK细胞的细胞毒性。未转导和转导的NK细胞在E:T比为0、0.5和1下与K562细胞共养4小时。未转导的NK细胞以剂量依赖的方式杀伤K562细胞。敲降HLA-ABC和/或表达PD-L1并未显著影响NK细胞对K562细胞的杀伤。出乎意料的是，表达SCE或PD-L1（无论是否联合HLA-ABC敲降）显著增强了NK细胞对K562细胞的杀伤（在E:T比为1时，裂解率从30%增至60-70%）。总之，这些体外结果表明：(i) 异体NK细胞中的HLA-ABC敲降比过表达SCE和/或PD-L1更能有效抑制宿主CD8⁺ T细胞的杀伤；(ii) 过表达SCE比过表达PD-L1更能有效抑制宿主NK细胞对HLA-ABC降低的异体NK细胞的杀伤；(iii) 过表达SCE和PD-L1显著增强了NK细胞对K562靶细胞的杀伤。

Allogeneic NK cells with HLA-ABC knockdown and PD-L1 or HLA-E expression evade host immune cell rejection in vivo

研究人员测试了具有HLA-ABC敲降但过表达PD-L1或SCE的异体NK细胞在体内是否能逃逸宿主T细胞和NK细胞的排斥。在第一组实验中，来自供体1（HLA-A02:01⁺）的纯化NK细胞用表达shRNA#13和SCE的慢病毒载体转导。将转导和未转导的NK细胞与等量的来自供体2（HLA-A02:01^-）的PBMC混合，并过继转移至同样缺乏MHC I类和II类分子（NSG MHC I/II DKO）且已在2天前接受照射的NSG小鼠体内。在过继转移前、转移后7、14和21天外周血中以及转移后21天肺、肝、脾和骨髓中，通过流式细胞术分析人NK细胞和T细胞。转导的供体1NK细胞被鉴定为CD45⁺CD56⁺HLA-ABC降低HLA-E⁺HLA-A02:01⁺；未转导的供体1NK细胞被鉴定为CD45⁺CD56⁺HLA-ABC⁺HLA-E^-HLA-A02:01⁺；供体2 PBMC中的NK细胞被鉴定为CD45⁺CD56⁺HLA-ABC⁺HLA-E^-HLA-A*02:01^-。在过继转移前，供体1转导和未转导NK细胞在总NK细胞中的相对比例各约为45%，而供体2 NK细胞的比例约为10%。转移后7天，供体1转导NK细胞的比例增加至约70%，转移后14和21天增加至约80%。供体1未转导NK细胞的比例在转移后7天降至约10%，在转移后14和21天降至<5%，而供体2 NK细胞的比例增加至约20%。一致地，在转移后21天，供体1转导NK细胞在肺、肝、脾和骨髓中的比例约为80%，而供体1未转导NK细胞在这些组织中的比例<5%。供体2 NK细胞和供体1 NK细胞（转导或未转导）在过继转移前后的CD107a表达没有显著变化。因此，来自供体1的未转导NK细胞（HLA-ABC⁺ SCE^-）在受体小鼠中被优先清除，而转导的NK细胞（HLA-ABC^-/low SCE⁺）则未被清除。研究人员还检测了受体小鼠中供体2 T细胞的相对水平及其以CD69表达为标志的激活状态。在人CD45⁺细胞中，T细胞的百分比在过继转移前的细胞混合物中约为25%，且很少表达CD69。转移后7、14和21天，外周血中人CD45⁺细胞中T细胞的百分比增加至45-50%，在组织中增加至约50%。值得注意的是，CD69⁺ T细胞的百分比在转移后7天增加至约60%，随后在血液中于14天和21天分别降至约20%和10%，在组织中于21天降至约10%。供体2 T细胞的激活（CD69表达