结合晶体片段筛选与深度突变扫描发现寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂

本研究针对寨卡病毒(ZIKV)NS2B-NS3蛋白酶这一关键抗病毒靶点，通过晶体片段筛选发现52个结合片段，结合深度突变扫描(DMS)技术分析耐药突变风险，揭示了结合位点的遗传约束性，为开发耐药弹性抗病毒药物提供了结构基础和理性设计策略。

　　

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）属于黄病毒科（Flaviviridae），与登革热病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）和黄热病病毒（YEV）亲缘关系密切。虽然大多数ZIKV感染症状轻微，但2015-2016年在巴西和法属波利尼西亚的疫情爆发显示，该病毒可导致新生儿小头畸形和成人吉兰-巴雷综合征，引发全球公共卫生关注。然而，目前尚无疫苗或抗病毒药物可用于预防或治疗ZIKV感染。

ZIKV的单股正链RNA翻译产生一个多蛋白前体，需要被宿主蛋白酶和病毒蛋白酶NS2B-NS3切割成单个功能蛋白。NS2B-NS3蛋白酶因此成为非常有吸引力的抗病毒靶点。NS3包含一个丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的蛋白酶活性位点，NS2B的约40个氨基酸作为NS3的辅因子，其C端残基形成β-折叠，在结构上贡献于蛋白酶活性位点并参与底物识别。

结构研究表明，NS2B-NS3蛋白酶存在多种构象：闭合构象、开放构象和超开放构象。在开放和超开放构象中，NS2B的C端部分无序且远离NS3催化位点，导致底物结合位点 unstructured，因此被认为是非活性形式。而具有良好结构化结合口袋的闭合构象为抗病毒开发提供了有希望的靶向机会。

针对NS2B-NS3蛋白酶的两种策略已被部署：第一种是开发在活性位点与底物竞争的特定抑制剂；第二种策略专注于靶向变构位点的非竞争性抑制剂。尽管付出了这些努力，但竞争性和非竞争性抑制剂均未进入临床试验。大多数已报道的竞争性NS2B-NS3抑制剂仅限于肽模拟物，如大环抑制剂，虽然这些肽模拟抑制剂对ZIKV NS2B-NS3蛋白酶显示出纳摩尔级别的效力，且一些还具有广谱抗病毒活性，能抑制登革热病毒、西尼罗河病毒和寨卡病毒的增殖，但它们的细胞活性和药代动力学性质较差。同时，大量努力集中在开发变构抑制剂上，这些抑制剂阻断NS2B和NS3之间的相互作用并将蛋白酶锁定在非活性形式。这一策略已产生几种有效的非竞争性抑制剂，包括在细胞试验中显示抗病毒活性的NSC135618。然而，由于缺乏可靠的结构信息，变构位点以及变构抑制剂结合模式尚未得到适当验证。

病毒可能对任何抑制剂产生耐药性，特别是当抑制剂结合的氨基酸位点具有足够的突变耐受性，且那些破坏抑制剂结合的突变不会严重损害病毒适应性时。为了优先选择表现出遗传约束性的NS2B-NS3结合片段（从而降低耐药性进化风险），研究人员对NS2B-NS3蛋白酶进行了深度突变扫描（DMS）。DMS是一种高通量实验技术，依靠深度测序技术测量蛋白质每个位置每种可能氨基酸突变的效果。DMS已成为病毒学研究中的强大工具，特别是在病毒适应性和进化研究中。最近对病毒蛋白（如SARS-CoV-2刺突蛋白和ZIKV包膜蛋白）突变潜力的研究为抗体工程和疫苗设计提供了丰富的序列-功能关系信息。

在这项工作中，研究人员将晶体片段筛选与DMS相结合，以加速开发针对ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的耐药弹性抗病毒治疗剂。他们对1076个片段进行的晶体片段筛选在活性位点和一个潜在变构位点识别了多样化的化学支架，为快速后续化合物设计提供了片段结合的结构细节。DMS结果揭示了配体结合热点的突变潜力，这将指导合理的化合物设计，在药物化学的早期阶段抑制耐药性。

关键技术方法

研究人员建立了适合片段筛选的晶体系统（cZiPro），使用XChem设施对1076个片段进行了晶体片段筛选，采用深度突变扫描（DMS）技术分析NS2B-NS3蛋白酶的突变耐受性，利用Creoptix Wave系统进行结合亲和力测定，并通过荧光剂量反应测定评估抑制活性。

建立适合片段筛选的晶体系统

几种构建体已被报道可有效生成与NS2B辅因子区域结合的ZIKV NS3蛋白酶。这些方法包括在NS2B和NS3之间插入甘氨酸 linker（如名为gZiPro的构建体），以及在双顺反子载体中共表达NS2B辅因子和NS3蛋白酶（如名为bZiPro的构建体）。gZiPro构建体已常用于ZIKV NS2B-NS3蛋白酶研究，但人工的富含甘氨酸的 linker 引起了对改变底物结合行为的担忧。因此，未连接的二元NS2B-NS3蛋白酶是更受青睐的研究对象。此外，bZiPro成功产生了ZIKV NS2B-NS3的闭合构象结构（PDB ID：5GPI）。

为了生产用于片段筛选的闭合构象ZIKV NS2B-NS3蛋白酶晶体，研究人员生成了PDB结构5GPI的修改版本。5GPI模型在不对称单元中包含4个蛋白质分子，其中一个分子的NS3 N端残基与邻近的活性位点结合，这使得该系统不适合晶体浸泡。该系统的另一个问题是在研究人员手中bZiPro构建体的表达产量较低。为了解决这些问题，研究人员生成了一个名为cZiPro的构建体。在该构建体中，他们移除了5GPI结构中NS2B的无序C端残基和NS3的N端残基。这种优化的构建体产生了高量的ZIKV NS2B-NS3蛋白酶，并可重复产生衍射约1.6?的晶体。

研究人员的NS2B-NS3结构（PDB代码：8PN6）在P4322空间群中确定，不对称单元中只有一个蛋白质分子，这与5GPI模型不同，但两种结构的叠加显示骨架均方根偏差（RMSD）约为0.2?。研究人员结构中的活性位点不会被晶体堆积阻塞，可通过晶体浸泡进入，因此适合进行片段筛选。

cZiPro和bZiPro之间的结构相似性支持了它们观察到的功能等效性。两种酶显示出相当的酶活性，Km值约为6μM，且比gZiPro具有更高的催化效率，与先前的研究一致。此外，所有三种蛋白酶同样被牛胰胰蛋白酶抑制剂（BPTI）抑制，IC₅₀值接近150nM。通过差示扫描荧光法（DSF）测量，bZiPro和cZiPro表现出相似的热稳定性，熔化温度（T_m）分别为47.3°C和46.6°C。相比之下，gZiPro的热稳定性最高，T_m为50.8°C，这可能是因为其NS3和NS2B辅因子之间存在共价连接。

通过晶体片段筛选识别片段命中

研究人员使用已建立的晶体系统，在Diamond Light Source的XChem设施对1076个片段进行了晶体片段筛选。共获得1058个数据集，分辨率范围为1.3-2.3?，其中812个数据集通过PanDDA分析成功处理。共识别出52个独特的片段命中，其中46个结合在活性位点，6个结合在一个潜在变构位点（一个片段同时结合活性位点和变构位点）。识别出多样化的化学支架，包括噻吩并苯并噻唑/苯并咪唑、哌嗪和喹啉基片段。其他部分如酰胺、吡唑和砜在筛选的片段中也常见。

活性位点中配体结合的相互作用模式

基于Schechter-Berger命名法，NS2B-NS3蛋白酶活性位点分为S1、S1'、S2和S3亚位点。在活性位点观察到的46个片段中，43个结合在S1位点，1个在S1'位点，2个在S2位点，表明S1亚位点是片段结合的热点。S1位点的片段姿势，如x0089，经常被观察到与Tyr161的侧链形成π堆积。x0089通过三个氢键进一步稳定，分别与Asp129的侧链、Tyr130的骨架和一个水分子相互作用。同时占据S1和S1'位点（S1-S1'）的片段x1098与Tyr161和His51的侧链形成两个π-π堆积相互作用。此外，其酰胺基序与Gly151的骨架形成氢键，并与Tyr161的侧链形成水介导的氢键。

S2位点结合剂哌嗪片段x0404与Asp83（NS2B）形成静电相互作用，而其苯环与His51形成π堆积相互作用。研究人员还观察到一个片段姿势x0846b（片段结合两个位点，姿势b靠近催化残基His51），它位于S1'位点，分别与Val36和Val52的骨架形成两个氢键。其苯并咪唑环与周围残基（如Val36、Leu30和Met51（NS2B））形成疏水相互作用。

片段-蛋白质相互作用分析显示，π堆积是与片段结合最常见的相互作用，超过一半的片段与Tyr161形成π堆积，约三分之一的片段与His51形成π堆积。Asp129和Tyr130也被观察到与近四分之一的识别片段形成氢键，与Tyr161和His51一起使S1位点成为配体结合的热点。此外，来自NS3的His51、Ser135和Asn152以及来自NS2B的Asp83也被观察到与多个片段形成相互作用，表明它们对配体结合的潜在贡献。

深度突变扫描测量ZIKV NS2B-NS3的突变耐受性

鉴于病毒蛋白酶经常通过对关键残基的突变进化出对抑制剂的耐药性，例如HIV-1和HCV NS3/4A蛋白酶的药物耐药性，了解ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的突变耐受性对于设计耐药弹性抗病毒药物至关重要。为了全面了解特定氨基酸替换（尤其是在关键配体相互作用残基处）如何影响蛋白酶的功能和配体结合，研究人员采用了深度突变扫描（DMS）。具体来说，研究人员使用先前报道的ZIKV原型株MR766感染性克隆，生成了编码整个ZIKV NS2B-NS3编码序列所有单氨基酸替换突变体的文库。为了确保在文库克隆和筛选阶段全面覆盖所有可能的突变，研究人员将NS2B-NS3编码序列分为三个不同的"tile"，并为每个tile创建了多个突变质粒文库（tile 1和2各三个，tile 3两个），在所有后续步骤中分开处理以提供真正的生物学重复。每个文库平均包含2.7×10⁴个独特质粒克隆，这过度代表了3296个可能密码子变体的总数（32种NNK组合乘以103个密码子）的819倍，平均每个克隆有1.05个突变。

通过用质粒DNA文库转染HEK 293T细胞产生突变病毒池，并通过在Huh-7.5细胞中传代选择病毒适应性。研究人员使用深度测序来量化突变病毒中每种突变相对于初始质粒突变文库的频率。预计 uniformly 有害的终止密码子被大量清除，许多将有害的非同义突变频率降低。

研究人员接下来估计了NS2B-NS3蛋白酶蛋白中每个位点对每种氨基酸的偏好性。这些偏好性代表了经过病毒生长选择后每个位点每种氨基酸的富集情况， normalized 到每个位点野生型密码子的丰度。尽管存在一些噪音，但偏好性在三个重复之间 strongly 相关。研究人员通过实验量化了一组个体NS2B-NS3突变体的相对适应性，发现这些值与DMS测量的突变效应高度相关（Pearson相关系数为0.769）。

任何给定密码子的突变耐受性可以从该位点每个个体突变对病毒适应性的影响中确定。NS2B-NS3蛋白酶蛋白中每个位点每个突变的效应的跨重复平均值计算为频率的对数倍变化， normalized 到野生型对照频率的变化，并在热图中表示。在适应性的低端，终止密码子突变和催化三联体突变被认为是有害的。因此，它们的突变效应已被应用为NS2B-NS3突变效应分布中的参考集。基于上述个体突变体适应性的实验测试，以及研究人员先前对包膜蛋白突变耐受性的分析，研究人员将适应性的突变效应阈值设为-1.0，用于那些被耐受并允许病毒生长的突变，即使适应性从野生型降低。

NS2B-NS3中的大多数突变降低了病毒在Huh-7.5细胞中的适应性，表明许多残基的突变耐受性较低。然而，一些残基，如NS2B残基88-94和NS3残基12-20，表现出高度的突变耐受性。值得注意的是，这些位点的突变不会降低病毒在Huh-7.5细胞中的适应性，而是显示出与这些位点具有野生型残基（X）的病毒相似的适应性。一些位点，如NS3 Arg106，显示出高度的变化耐受性，并且在引入某些突变时适应性增加。蛋白质中具有高突变耐受性的残基不是配体结合位点的良好候选者，因为破坏配体结合的突变不会损害病毒适应性。

为了促进这些数据的分析，研究人员生成了一种称为"适应性视图"的可视化方案，将每个残基的突变耐受性映射到晶体结构上。白色的表面表示突变不耐受的位点，而深红色的残基代表高度的突变耐受性。总体而言，这种适应性图谱提供了关于NS2B-NS3蛋白酶蛋白中序列-功能关系的丰富信息，可用于指导合理抗病毒设计中选择关键相互作用残基。

适应性视图揭示活性位点配体结合的潜在突变效应

对活性位点适应性视图的检查显示，S1'和S2亚位点相对不耐受突变，而NS2B中的少数位置显示突变耐受性，表明存在潜在耐药突变的风险。具体来说，S1亚位点的Tyr130可能突变为多个氨基酸，如半胱氨酸、谷氨酸。在位置132，半胱氨酸和脯氨酸替换预计具有与野生型丙氨酸相似的复制效率。尽管Tyr130和Ala132具有高突变性，但研究人员筛选中的S1片段结合剂主要与Tyr130的骨架相互作用，并与Ala132有间接接触。因此，预计Tyr130和Ala132的潜在突变对配体结合的影响有限。类似地，NS2B C端的Gly82和Phe84的突变灵活性不太令人担忧。Phe84未被观察到参与片段相互作用，而Gly82使用其骨架进行片段相互作用。

然而，NS3位置161的酪氨酸突变为苯丙氨酸的潜在可能性引起了研究人员的关注。尽管Tyr161主要通过π堆积贡献于片段相互作用，这可以被苯丙氨酸取代，但研究人员也观察到片段，如x0719，与Tyr161的羟基形成直接H键。将酪氨酸突变为苯丙氨酸会消除氢键形成。因此，建议避免与Tyr161形成氢键，以降低耐药性概率。相比之下，S1亚位点的关键相互作用残基Asp129和S2亚位点的Asp83（NS2B）是突变不耐受的，表明片段生长的机会。

适应性视图否定已报道变构位点作为耐药稳健机会

在正交位点之外观察到了六个片段命中，位于催化残基下方、NS2B的C端β-折叠和NS3之间界面旁边的口袋中。这个潜在变构位点包含两个亚口袋，命名为变构位点AS1'和AS2'。ASI'以Trp69和Trp83为主要相互作用残基。一个例子，片段姿势x0130，与Trp69的侧链形成π堆积，并通过与Trp83的骨架氢键进一步稳定。

AS2'主要由疏水残基形成，包括来自NS3的Phe116、Ile123、Ala164和Ile165，以及来自NS2B的Leu78和Phe84。在AS2'中观察到了四个具有不同支架的片段，具有不同的姿势。片段x0806包含一个苯环，与周围的疏水残基形成疏水相互作用，而其三唑环的氮原子N2与Gln167的骨架形成氢键。其胺基与一个水分子形成另一个氢键。相比之下，结合在AS2'中的片段x0777表现出完全不同的结合模式。其羟基与Thr118和Asp120的侧链形成两个水介导的氢键。其噻二唑环的N2原子与Asp71形成另一个水介导的氢键，另一个氮原子（N5）与溶剂中的水形成氢键。其5碳环嵌入由Ile123、Phe116和Ala164形成的疏水空腔中。总之，结合在这个非活性位点的片段映射了一个位于NS2B的C端β-折叠和NS3界面旁边的潜在变构口袋。这一观察与先前通过对接和突变研究表征ZIKV NS2B-NS3中变构口袋的工作一致。

研究人员接下来研究了变构位点中关键相互作用残基的遗传灵活性。与活性位点相比，变构位点具有相对较高的可突变性。特别是，残基Asp71和Thr118的突变灵活性引起了研究人员的关注。Asp71被观察到通过氢键与片段相互作用。其突变为丝氨酸的潜力会改变其电荷以及侧链长度，增加了维持与配体相互作用的风险。类似地，极性残基Thr118具有突变为丙氨酸的潜力，这会消除其形成氢键的能力。考虑到变构位点中潜在的突变风险和未明确的关键相互作用残基，靶向这个变构位点在这项研究中被降低了优先级。

识别片段在结合和活性测定中未检测到

为了进一步评估筛选的片段结合剂是否具有可测量规模的结合亲和力和抑制活性，研究人员使用基于GCI的waveRAPID系统表征片段结合剂以确定结合亲和力，并使用荧光剂量反应测定以确定它们的抑制活性。waveRAPID是为化合物和片段筛选开发的，已证明能够检测低毫摩尔范围的结合亲和力。尽管如此，研究人员无法获得可靠的结果或可测量的信号来 confidently 验证片段结合剂使用这种结合测定。不出所料，所有筛选的片段在生化测定中均未表现出抑制活性。这种观察在许多晶体片段筛选中很常见，其中只有低百分比的晶体片段命中可以在生物物理或生化测定中可靠检测到。不同片段筛选测定（如NMR、MST和酶抑制测定）的比较研究进一步支持了这一点，显示片段命中的重叠有限。

值得注意的是，阳性对照化合物在研究人员测定中对ZIKV NS2B-NS3显示出1.8μM的IC₅₀，与先前的研究一致。然而，其对DENV2 NS2B-NS3的效力显著更好，报道的IC₅₀值在低纳摩尔范围。这一观察强调了开发靶向黄病毒NS2B-NS3蛋白酶的广谱抑制剂的挑战和机遇，并突出了在一组NS2B-NS3蛋白酶上采用并行生化和生物物理测定的重要性。

通过片段合并和连接进行快速后续化合物设计的机会

检查活性位点中的片段-蛋白质相互作用分析和适应性视图，选择片段x0852、x1098、x0404和x0846b作为合并的代表性例子。片段姿势x0852重现了S1位点中观察到的核心相互作用，特别是与Tyr161的芳香相互作用，与Tyr130骨架的氢键。x1098是唯一被观察到用酰胺基序桥接S1和S2位点的片段。其苯环与S1位点中片段x0852的苯环很好地叠加，表明这些片段可以合并成一个单一的、更大的支架。此外，x1098在S2位点与片段x0404部分重叠。合并x1098和x0404衍生出一个苯甲酰胺-（吡唑基）哌啶支架，将小分子扩展以同时接合S1、S1'和S2位点，由Enamine化合物Z2451096209代表。

这种苯甲酰胺-（吡唑基）哌啶易于获得，有超过1000种类似物。它们通过称为Fragmenstein的算法计算进一步评估，该算法基于合并物的姿势应保留其母体片段姿势的原则。研究人员将预测合并物的构象偏差限制在与其母体命中相比小于1?，以 potentially 维持其母体片段相互作用。例如，合并物PV-004740099668相对于其母体片段姿势x0852和x1098具有0.82?的RMSD，合并物Z2451096209相对于其母体片段姿势x1098和x0404具有0.27?的RMSD。

为了进一步分析合并片段是否可以实现效力，研究人员评估了ASAP-0022538（PDB ID：7I9O）的结合姿势，这是Kenton等人在使用研究人员筛选片段的后续片段到先导工作中报道的一个命中。该化合物重现了片段姿势和片段-蛋白质相互作用。ASAP-0022538似乎与x0089、x1098和x0404的姿势对齐。其苯并咪唑与S1位点中的片段x0089重叠，重现了与Tyr161的芳香相互作用和与Tyr130的氢键。ASAP-0022538的酰胺连接器维持了与Gly151骨架的氢键，如片段x1098所做。其苯环与His51之间的芳香相互作用，以及胺基与Asp83（NS2B）之间的静电相互作用，重现了在片段x0404中观察到的相互作用。结合这些相互作用基序，ASAP-0022538被报道显示出可测量规模的效力，IC₅₀值为14.2μM。

值得注意的是，ASAP-0022538的设计与这项工作分开执行，因此研究人员的基于片段的分析是回顾性的。然而，研究人员片段作为抑制剂发现基础的效用被Kenton等人证明，他们使用研究人员的片段数据启动并完成了一个完整的片段到先导活动。作者报道了在他们的活动中使用药效团基序的机器学习结合迭代DMTA循环，将片段推进到低纳摩尔效力。

手动片段合并相对简单，但主要限于纯合并，如研究人员案例中的Z2451096209，它 incorporated 母体片段的确切子结构。充分利用化学空间、整合关键片段-蛋白质相互作用并从可能合并中可靠排名化合物的合并算法对于直接从片段筛选中识别ASAP-0022538-like有效合并是有希望的。这种方法在Wills等人中描述，虽然需要进一步改进方法学，但化合物ASAP-0022538证明了其可行性。

除了合并，研究人员观察到片段x0846b，它独特地位于S1'位点，提供了通过甲基连接器与x1098连接的机会，而不会引起 strain 或内部冲突。这得到了0.67?的RMSD值的支持，与其母体片段相比，同时保持合理的甲基连接器角度（112°）。这个结合区域尚未被探索用于小分子接合。研究人员的观察，尽管只有一个片段，带来了多样化支架抑制剂开发的机会。

为了进一步探索化学多样性，研究人员使用所有筛选的片段作为输入，使用Fragmenstein进行合并。自动合并、目录搜索和约束对接揭示了大量（约4000个过滤目录化合物）和多样化的可能合并可以探索，例如苯并咪唑基化合物Z4192072491（Enamine）和吡唑萘MCULE-8919924892。合并物和类似物对接都用Fragmenstein计算，最终化合物被预测忠于母体片段（RMSD<1?），不违反能量评分函数（结合ΔG_calc<-5kcal/mol）。从算法合并中建议的丰富和多样化的化学物质表明，研究人员筛选的片段是高度可社交的， enabling 许多可能的探索途径。

研究结论与意义

研究人员获得了一个 robust 的ZIKV NS2B-NS3晶体系统，使成功的晶体片段筛选成为可能。采样的片段命中为快速后续化合物设计提供了多样化的可能起点。这为这个抗病毒靶点带来了机遇，目前正交位点抑制剂主要限于肽模拟物。此外，片段-蛋白质相互作用分析强调S1亚位点是正交位点抑制剂开发的主要靶向机会。这得到超过80%的观察片段位于这个区域的支持。在S1位点观察到如此高的命中率可能是由于主要由Tyr150和Tyr161的庞大侧链形成的深口袋。

耐药性仍然是开发有效蛋白酶抑制剂的主要挑战之一。先前药物发现活动（如靶向HIV-1蛋白酶）的教训强调了了解关键相互作用残基如何耐受突变的重要性。为了解决这个问题，研究人员应用DMS来分析目标蛋白的突变景观。这种方法有助于评估片段-蛋白质相互作用和优先选择要推进的片段。晶体片段筛选由于其高灵敏度，通常采样数十个片段结合剂，但并非所有都能有效推进到先导。选择有希望的化学起点片段需要仔细过滤。突变分析可以作为一个强大的过滤器用于片段选择，特别是对于抗病毒靶点。例如，与高度可变残基相互作用的片段（如x0719）可能被降低优先级用于片段推进，因为这种相互作用很容易被病毒进化破坏。

此外，突变谱约束了配体结合的结合区域，为片段生长提供了理性指导。例如，突变不耐受残基如S1位点的Asp129和S2位点的Asp83（NS2B）表明片段精细化的生长向量。研究人员建议在药物发现的早期阶段纳入DMS，为片段推进提供理性指导，并支持弹性抗病毒化合物设计。

多个黄病毒NS2B-NS3蛋白酶的变构位点已被提出，但没有结构描述。研究人员在此呈现的片段筛选数据有助于缩小这一知识差距，并用结构细节映射变构位点。尽管研究人员在此描述的变构结合口袋存在于闭合构象中，但它与先前报道的 proposed 变构位点一致，支持NS2B的C端β-折叠和NS3界面的"可配体性"。然而，从研究人员筛选中观察到的 distinct 结合姿势和相互作用表明非竞争性抑制剂开发的挑战。更重要的是，DMS数据揭示了