靶向MCL1单药及联合AKT抑制策略揭示前列腺癌分子分层治疗新路径

本研究针对转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）的治疗难题，通过分析多组患者活检队列与患者来源模型，发现MCL1拷贝数增益（14%-34%）与不良预后相关。研究人员开展MCL1抑制单药及与AKT抑制剂联用的治疗策略研究，证实联合干预在PTEN缺失/PI3K激活模型中通过调控BAD-BCLXL与BIM-MCL1相互作用诱导癌细胞特异性死亡，并在AKT抑制剂耐药模型中保持持续抗肿瘤活性。该研究为MCL1增益型mCRPC的单药治疗及PTEN缺失/PI3K激活型mCRPC的联合治疗提供了临床前依据，支持早期临床试验的开展。

　　

转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）是一种高度致命的疾病，中位总生存期仅2-3年，亟需新的治疗策略。细胞凋亡逃逸是癌症的重要特征之一，而抗凋亡蛋白MCL1（Myeloid Cell Leukaemia 1）作为BCL2（B-cell lymphoma 2）家族成员，在多种恶性肿瘤（包括前列腺癌）中促进癌细胞存活。尽管MCL1是人类恶性肿瘤中最常扩增的基因之一，但其在mCRPC中的作用机制尚未明确。此外，MCL1可能参与对雄激素剥夺疗法（ADT）和DNA损伤化疗的耐药过程，并在治疗诱导的衰老前列腺癌细胞中促进存活，这些细胞通过衰老相关分泌表型（SASP）促进肿瘤增殖和转移，近年来被发现在内分泌治疗抵抗中起关键作用。

尽管针对BCL2家族蛋白的小分子BH3模拟物已被开发，但由于抗凋亡BCL2家族成员（包括BCLXL）的功能冗余，单靶点治疗的抗肿瘤活性有限。研究表明，前列腺癌同时依赖MCL1和BCLXL，需同时抑制两者才能诱导凋亡。因此，识别对MCL1抑制单药有反应的前瞻性生物标志物，并发现合理的MCL1抑制剂联合策略，成为解决临床迫切需求的关键。

本研究发表在《Nature Communications》，通过分析多组mCRPC活检队列和患者来源模型，评估了对MCL1抑制的反应。研究发现MCL1拷贝数增益（14%-34%）与MCL1表达增加和较差预后相关。MCL1抑制在MCL1增益的mCRPC模型中表现出抗肿瘤效果。MCL1与AKT的协同抑制在PTEN缺失/PI3K激活的模型中诱导癌细胞特异性死亡，调控BAD-BCLXL和BIM-MCL1相互作用，并在AKT抑制剂获得性耐药模型中保持持续抗肿瘤活性。此外，CDK9介导的MCL1下调与AKT抑制联用可重现这些发现，为临床转化提供更多机会。

研究人员运用了多种关键技术方法：通过荧光原位杂交（FISH）和低通量全基因组测序分析MCL1拷贝数变异；利用RNA测序和免疫组化（IHC）检测MCL1表达；采用患者来源异种移植类器官（PDX-O）和小鼠前列腺癌建模平台类器官（ProMPt-O）进行体外和体内药效评估；通过FDA批准药物库筛选协同组合；使用siRNA敲低技术验证靶点机制；借助免疫共沉淀（Co-IP）和邻近连接 assay（PLA）分析蛋白相互作用。

MCL1拷贝数增益在致死性前列腺癌中常见，出现于肿瘤进化早期，并随着去势抵抗性增加

研究人员在多组前列腺癌活检队列中检测MCL1基因拷贝数变异。结果显示，在来自癌症基因组图谱（TCGA）队列的原发性前列腺癌中，MCL1扩增（高水平拷贝数增益）罕见（1%），而在Stand Up To Cancer/前列腺癌基金会（SU2C/PCF）队列的晚期CRPC活检中更为常见（14%）。对皇家马斯登医院（RMH）队列的匹配同患者CSPC和CRPC活检分析显示，MCL1扩增频率相似（CSPC 11.36%，CRPC 13.64%），表明该事件发生在肿瘤进化早期，并与CRPC发展相关。然而，与匹配的同患者CSPC活检（15.91%）相比，更高比例的CRPC活检（34.09%）表现出MCL1拷贝数增益，提示这可能是随着治疗抵抗出现的适应性反应。

MCL1拷贝数增益与较差的临床结果相关

在原发性前列腺癌（TCGA队列）中，MCL1拷贝数增益/扩增与显著较短的无进展间期（PFI）（HR 1.93，CI 1.05-3.53，p=0.03）、更高的Gleason评分和病理肿瘤分期以及诊断时淋巴结受累机会增加相关。此外，在一项评估6个月新辅助ADT和enzalutamide治疗高危前列腺癌的II期试验中，基线时MCL1体细胞拷贝数增益与较差的病理治疗反应相关。37个肿瘤中有4个（11%）具有MCL1拷贝数增益/扩增，所有这些均被分类为病理不完全或无反应者。在mCRPC中，对FIRSTANA和PROSELICA临床试验患者血浆游离DNA的分析显示，MCL1拷贝数增益/扩化与较短的总生存期相关（HR 1.35，CI 0.95-1.90），且与第二代激素治疗暴露相关。

MCL1 RNA和蛋白在mCRPC中高表达

转录组分析显示，在TCGA和SU2C/PCF队列以及华盛顿大学/弗雷德哈钦森（UW/FH）CRPC快速尸检队列中，MCL1拷贝数增益/扩增与RNA表达增加相关。RMH队列也观察到相同趋势，尽管无统计学显著性（p=0.301）。这些数据强调了MCL1拷贝数增益/扩增的功能意义。然而，大量拷贝数未改变的肿瘤也表现出高RNA表达，表明其他机制也可驱动MCL1过表达。免疫组化（IHC）显示MCL1 RNA表达与MCL1蛋白胞质光密度值呈正相关（n=30，Spearman r=0.482，p=0.007），表明RNA水平升高导致功能相关蛋白表达。

对MCL1抑制的反应在具有MCL1拷贝数增益的PC模型中被富集

研究表征了7个前列腺来源细胞系，发现22Rv1和DU145具有MCL1拷贝数增益；然而，仅22Rv1表现出明显升高的MCL1蛋白水平。其中，22Rv1对MCL1抑制最敏感，表现为caspase 3/7活性增加和细胞活力降低。LNCaP95表现出相当的反应，表明对MCL1抑制的敏感性可能受其他因素影响。DU145缺乏反应可能源于BAX缺陷导致的凋亡抵抗。对五个具有不同MCL1拷贝数和蛋白水平的CRPC PDX-O模型的评估显示，在具有MCL1拷贝数增益的模型CP50c和CP267c中，AZD5991和S63845增加了caspase活性并降低了类器官活力，而拷贝数未改变且蛋白水平较低的模型（CP142c、CP253c和CP336c）受影响最小。

MCL1抑制与PI3K抑制协同触发CRPC细胞凋亡

通过筛选166种FDA批准药物（5μM），发现PI3K通路抑制剂（copanlisib、idealisib、duvelisib和alpelisib）与AZD5991（1μM）联用表现出协同效应，在C4-2和LNCaP95中降低细胞活力并诱导凋亡，而在正常前列腺上皮细胞PNT2中无此效应，表明该组合选择性杀死肿瘤细胞。使用copanlisib和buparlisib在不同浓度下的验证实验显示，与AZD5991联用时，caspase 3/7活性呈剂量依赖性诱导，并伴随细胞活力剂量依赖性降低。

MCL1抑制与AKT抑制协同触发CRPC细胞凋亡

AKT抑制剂（capivasertib和ipatasertib）与MCL1抑制剂AZD5991联用在LNCaP95和C4-2细胞中产生的ZIP协同分数超过PI3K抑制剂。这些结果在NCI进行的42种药物（30种不同机制）的全面筛选中得到独立验证。MCL1抑制剂S63845与PI3K抑制剂copanlisib和paxalisib以及AKT抑制剂capivasertib和ipatasertib联用，在LNCaP95细胞中48小时降低细胞活力。蛋白分析进一步验证了AZD5991与capivasertib和ipatasertib联用对凋亡的诱导作用，表现为PARP、caspase 7（western blot检测）和caspase 3（western blot和IHC检测）的切割。

AKT和MCL1协同抑制的抗肿瘤活性通过改变BAD-BCLXL和BIM-MCL1相互作用介导

通过促凋亡BCL2家族siRNA筛查发现，单独沉默BH3-only蛋白BIM和BAD以及线粒体孔形成效应蛋白BAK部分阻止了联合治疗诱导的凋亡（通过caspase 3/7 assay、切割caspase 3和切割PARP蛋白水平评估）和细胞活力降低（通过CellTiter-Glo评估）。当同时沉默BIM、BAD和BAK时，几乎完全挽救了联合治疗的效果。Western blot分析显示，BAK、BAD或BIM蛋白水平在治疗中无显著变化，但AKT抑制剂和联合治疗降低了BAD在Ser136的磷酸化。免疫共沉淀实验显示，ipatasertib增加了BAD-BCLXL和BIM-MCL1结合，而AZD5991（单药或与ipatasertib联用）破坏了BIM-MCL1和BAK-MCL1结合。

AKT和MCL1协同抑制在PTEN缺失/PI3K激活的CRPC细胞中触发BAK依赖性凋亡

在7个不同分子背景的细胞系中评估对AKT和MCL1协同抑制的反应，发现在PTEN缺失系（LNCaP、C4-2、LNCaP95）和PIK3CA突变系22Rv1中观察到协同的caspase 3/7激活和活力降低，这些细胞系具有较高的磷酸化BAD、总BAD、BIM和BAK水平。相反，在PNT2、DU145（均为PTEN WT）和PC-3（尽管有PTEN缺失）中未观察到协同效应。PC-3细胞具有低水平的磷酸化BAD、BIM和BAK，且依赖BAX而非BAK进行凋亡。

AKT和MCL1协同抑制在体内协同抑制肿瘤生长

在CP253c（PTEN缺失、AR-FL/AR-V7阳性且ERG重排）PDX模型中评估ipatasertib（50 mg/kg，口服，5天/周）和S63845（25 mg/kg，静脉注射，3天/周）的联合治疗效果。联合治疗显著抑制了肿瘤生长，而单药治疗无统计学显著效应，表明两药在体内存在协同相互作用。终末肿瘤的组织病理学检查显示，联合治疗反应中切割caspase 3显著增加，ipatasertib治疗降低了KI67，表明联合治疗通过触发凋亡抑制CP253c生长。此外，PI3K/AKT通路下游标志物（pGSK3B和pPRAS40）在ipatasertib单药和与S63845联合治疗中均下调。

对capivasertib获得性耐药的CRPC细胞仍对AKT和MCL1协同抑制敏感，而对MCL1抑制剂耐药的细胞则不敏感

通过逐渐暴露于浓度递增的capivasertib中，开发了capivasertib耐药（Capi-R）C4-2和LNCaP95细胞系。验证显示，与亲本细胞相比，Capi-R的capivasertib IC50增加超过10倍。在AZD5991存在下，LNCaP95和C4-2 Capi-R细胞中capivasertib的IC50显著降低，表明对该联合治疗敏感。此外，在LNCaP95和C4-2 Capi-R细胞中，capivasertib和AZD5991联合使用时协同增加了caspase 3/7活性。Western blot分析进一步验证了凋亡诱导。BAK、BAD和BIM在Capi-R细胞中下调，其中C4-2的下调比LNCaP95 Capi-R细胞更明显，这可能有助于降低对联合治疗的敏感性。值得注意的是，capivasertib处理降低了C4-2和LNCaP95 Capi-R细胞中BAD（Ser136）的磷酸化水平。

通过CDK9抑制靶向MCL1重现了MCL1抑制与AKT阻断联合在CRPC细胞中的表型

CDK9抑制剂fadraciclib在LNCaP95和C4-2细胞中孵育6小时显著降低了MCL1蛋白水平。AKT（使用capivasertib和ipatasertib）和CDK9（使用fadraciclib和AZD4573）的协同抑制协同诱导了凋亡并降低了细胞活力（24小时）。与AKT和MCL1协同抑制的机制一致，当细胞预先用BIM、BAD和BAK siRNA组合处理时，fadraciclib与AKT抑制剂联用诱导的caspase 3/7活性和细胞活力降低被阻止。此外，对AKT抑制剂和fadraciclib组合的反应谱与AKT和MCL1协同抑制相似，相同的细胞系、PDX-Os和ProMPt-Os对两种策略均敏感。CP253c PDX的体内分析显示，ipatasertib与fadraciclib联合显著降低了肿瘤生长，而单药治疗无显著影响。终末肿瘤的IHC检查显示，仅联合治疗反应中观察到切割caspase 3诱导，而两种单药治疗均降低了KI67，表明单药治疗影响细胞生长，而联合治疗在体内触发凋亡。

研究结论与讨论部分强调，MCL1拷贝数增益是致死性前列腺癌进化早期的 trunk 事件，与不良预后和治疗抵抗相关。单药MCL1抑制在MCL1增益型模型中有效，而AKT与MCL1协同抑制通过调控BAD-BCLXL和BIM-MCL1相互作用，在PTEN缺失/PI3K激活模型中诱导BAK依赖性凋亡，克服AKT抑制剂耐药。CDK9介导的MCL1下调与AKT抑制联用可重现这一效应，为临床提供替代策略。这些发现支持在MCL1增益型mCRPC中评估MCL1靶向单药治疗，并在PTEN缺失/PI3K激活型mCRPC中联合AKT抑制的早期临床试验开展。