末次冰期河马向中欧扩散的古DNA与测年证据揭示气候避难所种群动态

本期推荐：为解决晚更新世河马在欧洲的起源、演化关系及确切灭绝时间等争议问题，研究人员开展了针对上莱茵地堑河马化石的古基因组学与放射性碳测年综合研究。结果表明这些河马与现生非洲河马遗传联系紧密，其存在时间延续至末次冰期（Weichselian）中期的MIS3阶段（约47-31 kya），并曾与猛犸象等寒冷适应动物群共存。低基因组多样性提示其为小型孤立种群，研究颠覆了河马作为末次间冰期（Eemian）指示物种的传统认知，为冰期气候波动下大型哺乳动物扩散与生存策略提供了关键证据。

　　

在波澜壮阔的第四纪历史中，欧洲大陆的动物群曾随着冰期与间冰期的交替而不断更迭。其中，河马（Hippopotamus amphibius）作为一种典型的热带、亚热带物种，其化石在欧洲的出现一直被古生物学家视为温暖间冰期的标志。传统观点认为，河马在末次间冰期（Eemian，距今12.9-11.5万年）结束时，随着末次冰期（Weichselian）的到来而于欧洲灭绝。然而，关于这些欧洲河马的演化来源、它们与现生非洲河马的确切关系，以及它们在中欧地区确切的灭绝时间，长期以来存在着诸多疑问。

为了解开这些谜团，由Patrick Arnold、Doris Doppes和Michael Hofreiter等领导的研究团队，对来自德国西南部上莱茵地堑（Upper Rhine Graben）多个采石场的晚更新世河马化石，进行了一次多学科的综合研究。他们巧妙地结合了古DNA测序技术与高精度的放射性碳测年方法，取得了颠覆性的发现，并将研究成果发表在了权威期刊《Current Biology》上。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术：首先，对19件河马化石样本进行了古DNA提取与测序，采用针对高度降解DNA优化的单链文库构建方法，并对内源DNA含量较高的样本（NK37）进行了全基因组测序（覆盖度约0.5x）；其次，通过杂交捕获技术富集了6个样本的线粒体基因组（mitogenome）进行测序；再者，对28件河马化石以及作为对比的15件猛犸象和披毛犀化石进行了胶原蛋白提取与加速器质谱（AMS）放射性碳（¹⁴C）测年，并对部分样本进行了傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析以评估胶原蛋白保存状况；此外，还利用基于釉质的氨基酸地质年代学（lcPD）对三件河马样本进行了辅助测年；最后，运用了多种生物信息学流程进行系统发育树构建、群体遗传多样性（θ）估算及演化时间校正分析。

RESULTS AND DISCUSSION

晚更新世欧洲河马与现生非洲河马存在紧密遗传联系

研究人员对来自上莱茵地堑的19个河马样本进行了古DNA分析。其中一个编号为NK37的样本（来自Eich采石场）内源DNA比例较高，被测序至约0.5倍的基因组覆盖度。测序读段显示出典型古代DNA损伤模式，支持其真实性。基于3085个拼接的5kb基因组窗口的最大似然系统发育重建表明，上莱茵地堑的河马样本NK37与两个现生非洲常见河马（ACH1和ACH2）的亲缘关系，比与现生西非倭河马（WPH，Choeropsis liberiensis）的关系更近。然而，NK37在非洲常见河马中的确切位置尚不明确，窗口树的分析显示出不完全谱系分选或基因流的存在。此外，通过杂交捕获技术，研究人员还获得了另外六个上莱茵地堑样本的部分线粒体基因组（完整度15%-78%）。线粒体系统发育重建表明，晚更新世上莱茵地堑的河马形成一个单系群，其线粒体多样性落在现生非洲常见河马的多样性范围之内。单倍型网络分析进一步支持了这一结论，表明这些欧洲河马并非一个 divergent 的分支，而是曾经广布、现今局限于撒哈拉以南非洲的 common hippo 的一部分。

河马在末次冰期中期存在于中欧

传统上认为这些河马化石源于Eemian间冰期，但这一判断仅基于河马是指示间冰期条件的物种这一假设。为了评估上莱茵地堑化石的真实年代，研究人员对样本进行了放射性碳测年。通过严格的预处理去除可能的历史时期保护涂层污染，并对胶原蛋白进行了FTIR光谱验证，最终成功对28个河马样本进行了测年。测年结果显示，其校准年代从测年上限（≥49 cal kya BP）一直到年轻的3.1万年 cal BP（图2）。对其中两个样本（NK47和NK24）的重复测年确认了其年轻的年龄。与此相对照，对来自相同或地理上接近地点的15件猛犸象（Mammuthus primigenius）和披毛犀（Coelodonta antiquitatis）化石的测年结果同样集中在4.7万至3.1万 cal BP之间，并且与河马的年代没有时间上的分离。对三个河马样本的釉质氨基酸地质年代学（lcPD）分析结果与“后Eemian”年龄并不矛盾，但由于该方法在该时间段分辨率较低，无法明确指定为MIS3年龄。综合沉积学、伴生动物群（无明显的埋藏学差异）以及该地区缺乏Eemian时期沉积层的事实，测年分析表明，河马在海洋同位素3阶段（MIS3），即末次冰期（Weichselian）中期，仍然存在于中欧。它们很可能与通常认为的寒冷适应动物群（如猛犸象、披毛犀）同时存在，或者更可能的是，在较短时间内（我们的数据无法分辨）周期性交替出现在上莱茵地堑，暗示了河马可能曾在间冰阶（interstadials）期间多次短期 colonize 该地区。

一个小的种群 colonized 了上莱茵地堑

放射性碳测年结果为追溯这些上莱茵地堑晚期幸存河马的起源提供了线索。研究人员利用线粒体基因组数据集、相关的样本尖端日期以及两种树先验模型（Bayesian skyline coalescence 和 birth-death）进行了贝叶斯时间校准。分析估计非洲-欧洲河马共同祖先节点（H. amphibius）的时间约为83.4万年（95% HPD: 38万年-160万年前），而上莱茵地堑河马最早的共祖时间估计在22.8万年前（95% HPD: 9.6万-40万年前）。这与欧洲最早的可确定的H. amphibius化石记录（来自意大利的中更新世沉积物，约45万年或更年轻）在时间上吻合，表明其 colonization 和 expansion 发生在多个间冰期，可能以隆河和莱茵河为主要扩散路线。 colonized 上莱茵地堑的种群很可能从南欧的避难种群中引入了深层的母系遗传谱系（>20万年）。

研究人员进一步通过估算NK37古基因组的全基因组多样性来评估这个晚期 colonizing 种群的遗传状态。尽管覆盖度低（0.47x），但在考虑了古代DNA损伤模式并基于X染色体数据重新校准测序质量后，其杂合度（θ）估计值在即使下采样到0.1x覆盖度时仍然稳健。样本NK37的基因组杂合度（θ平均值 = 0.00121）与西非倭河马WPH1（θ平均值 = 0.000843）相近，但显著低于两个现生非洲常见河马（ACH1 θ平均值 = 0.00486；ACH2 θ平均值 = 0.00431）。现生倭河马目前局限于西非的上几内亚森林，且呈 fragmented 的孤立种群分布。NK37同样较低的全基因组杂合度表明，上莱茵地堑的河马同样代表了一个小型、孤立的种群。

结论与意义

中、晚更新世的气候波动导致了环境及其栖息的大型哺乳动物群的 fundamental 变化。冰期和间冰期的动物群在气候条件有利时，分别从它们在欧洲东北部和南部的核心区交替 colonized 中欧地区。然而，对于晚更新世欧洲河马，其在中欧 colonized 和灭绝的时间，以及它们与非洲亲属的系统发育关系，直到现在才得以 resolve，尽管它们曾被认为是间冰期条件的 prime indicator。

本研究通过结合古基因组学和放射性碳测年技术，对来自上莱茵地堑的 putative Eemian 河马进行了综合分析。结果表明，这些河马是现生非洲常见河马（ACH）曾经广泛分布的一部分（尽管需要更多欧洲更新世及现生非洲河马的基因组数据来 disentangle 它们复杂的关系）。与传统观点相反，新测年的骨骼遗骸揭示，河马并未在Eemian期末从欧洲中部消失。一个小种群反而在MIS3期间重新 colonized 了中欧的上莱茵地堑，其来源很可能是南欧。因此，研究表明间冰阶阶段为河马（以及可能其他间冰期成分的物种）在末次冰期中期（至少是暂时性的） immigration 提供了一个温带气候避难所（refugium）。总之，河马在上莱茵地堑的晚期存在表明，其他 putative 的Eemian地点的化石也应该被重新分析，以评估该物种是否在西欧和中欧的其他地方（例如荷兰）也存活到了末次冰期。这项研究不仅改写了对河马这一标志性物种在欧洲演化和灭绝历史的认识，更重要的是，它揭示了冰期气候波动下，大型动物如何利用局部避难所环境实现 survival 和扩散，为我们理解过去气候变化对生物多样性的影响提供了 crucial insights。