通过突触门控与亲和力优化设计三特异性抗体实现T细胞衔接器双靶向选择性的突破

本综述系统阐述了TriMab（三特异性抗体）平台通过创新性设计策略——采用突触门控（synapse gating）机制与亲和力优化（affinity tuning）相结合的方式，显著提升T细胞衔接器（TCE）对双肿瘤相关抗原（TAA）共表达肿瘤细胞的选择性杀伤能力。研究证明，该平台通过高亲和力锚定臂（anti-ROR1）与低亲和力活性臂（anti-EGFR v3）的协同作用，在体外和体内均实现了超过500倍的选择性指数（TI）提升，有效规避单阳性正常细胞的脱靶毒性，为实体瘤治疗提供了新一代安全高效的TCE开发策略。

　　

引言背景

T细胞衔接器（TCE）作为一种革命性的免疫治疗策略，能够重新定向患者自身的T细胞识别并清除癌细胞。虽然TCE在血液肿瘤治疗中展现出显著疗效，但其在实体瘤中的应用仍面临重大挑战，主要源于肿瘤特异性抗原的缺失导致的靶向脱肿瘤毒性（on-target, off-tumor toxicity）和较低的治疗指数（therapeutic index, TI）。近年来，通过双抗原靶向策略选择性杀伤双阳性癌细胞而非单阳性正常细胞，被认为是提高TCE治疗指数的有效途径。

研究设计理念

本研究创新性地开发了一种条件性双靶向三特异性抗体TCE平台——TriMab。其核心设计包含三个关键要素：首先是一个高亲和力的非活性锚定臂（如抗TAA1），该臂虽能紧密结合单阳性细胞，但因表位和空间几何约束无法介导有效的免疫突触（immunological synapse, IS）形成；其次是一个亲和力优化的活性臂（如抗TAA2），其与抗CD3结构域相邻放置，仅在双靶点存在时通过亲合力效应（avidity effect）驱动有效的免疫突触形成；最后是抗CD3结构域用于招募T细胞。这种AND门控逻辑确保仅当肿瘤细胞同时表达两种TAA时，才能有效激活T细胞杀伤功能。

分子构建与表征

研究团队利用经临床验证的双特异性抗体平台DuetMab为基础，通过Knob-into-hole（KiH）异源二聚化技术及工程化二硫键与静电 Steering 突变实现三条重链与三条轻链的正交配对。TriMab分子包含三个不同的抗原结合片段（Fab）：Fab1（锚定臂）与Fc hole端连接，Fab2（活性臂）和Fab3（抗CD3）与Fc knob端连接。所有构建的TriMab分子（如ROR1/EGFR[v1-v3]）在CHO细胞中实现了高效表达（>200 mg/L），纯度超过95%，且轻链配对正确（kappa: lambda比例接近2:1）。通过液质联用（LC-MS）、差示扫描量热法（DSC）以及肽图分析等高级生物物理表征技术，证实了TriMab分子结构的正确性、高稳定性（Tm >61°C）以及所有预测二硫键的正确形成。

靶点选择与机制验证

研究人员选择受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）作为锚定臂靶点，表皮生长因子受体（EGFR）作为活性臂靶点进行概念验证。其中，抗ROR1克隆（ERR1-TOP43）因其高亲和力（9.5 nM）且自身不能介导T细胞依赖性细胞毒性（TDCC）而被选为理想的锚定臂。活性臂则采用抗EGFR克隆GA201的一系列亲和力渐降的变体（v1: 0.7 nM, v2: 8 nM, v3: 32 nM）。通过 sandwich 生物层干涉技术（BLI）和细胞水平竞争结合实验，证实了TriMab能同时结合ROR1、EGFR和CD3，并且降低活性臂亲和力可增强其对双阳性细胞的结合选择性（Fold-change parameter, FCP >1）。

体外功能研究

为评估TriMab的选择性杀伤能力，研究团队通过CRISPR/Cas9技术构建了ROR1敲除（KO）的NCI-H358肺癌细胞系（NCI-H358.ROR1.KO）。TDCC实验结果表明，携带低亲和力活性臂的ROR1/EGFR[v3] TriMab对双阳性NCI-H358细胞表现出强效杀伤（EC₅₀ ~0.5 nM），而对单阳性KO细胞则基本无活性（EC₅₀ >251 nM），选择性指数（FCP）高达502。相比之下，高亲和力版本（v1）的选择性则大幅降低（FCP=3）。此外，ROR1/EGFR[v3] TriMab在高效杀伤的同时仅引发基线水平的炎症因子（如TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-2）释放，展现出优异的治疗指数。这种选择性在多种不同受体表达水平的肿瘤细胞系（如AGS, Calu-1, MDA-MB-231, CACO-2）中也得到了一致验证。

机制深入探索

为阐明选择性背后的生物学机制，研究人员采用支持脂质双层（SLB）模型模拟肿瘤细胞膜，并通过共聚焦显微镜观察免疫突触的形成。实验发现，仅当SLB上同时存在ROR1和EGFR时，ROR1/EGFR[v3] TriMab才能有效诱导EGFR在T细胞-靶细胞界面聚集（免疫突触形成），而在仅表达EGFR（模拟正常细胞）的情况下则无此现象。这从机制上证实了锚定臂的“门控”作用是实现AND逻辑功能的基础。

平台通用性验证

为证明TriMab策略的普适性，研究团队进一步探索了以HER2为锚定臂的可行性。他们测试了结合HER2不同表位（膜近端Domain IV的曲妥珠单抗 vs. 膜远端Domain I的克隆4380）的锚定臂。结果表明，尽管两者细胞结合亲和力相近，但仅使用结合膜远端表位的克隆4380作为锚定臂时，HER2/EGFR[v3] TriMab才能实现高选择性杀伤（FCP 713-1100），而曲妥珠单抗作为锚定臂时选择性有限（FCP ~10-15）。这突显了锚定臂结合表位对其“门控”功能的关键影响。

药代动力学与体内疗效

在Tg32转基因小鼠（表达人FcRn）中进行的药代动力学（PK）研究显示，TriMab呈现单抗样的PK特征，其半衰期（t_1/2）为4.2-5.8天。重要的是，在NCI-H358异种移植瘤模型（采用NSG MHC I/II DKO小鼠并过继移植人PBMC）中，低剂量（0.5 mg/kg）的ROR1/EGFR[v3] TriMab治疗可完全抑制双阳性肿瘤的生长，而相应的活性臂单控（R347/EGFR[v3]）或锚定臂单控（ROR1/R347）TriMab则无抑瘤效果，充分证明了其体内选择性的AND门控活性。同时，研究还通过共培养实验证实，过量表达ROR1的单阳性细胞（CA46）的存在并不影响TriMab对双阳性靶细胞的杀伤效力，初步排除了因锚定臂高亲和力结合可能导致的“沉没效应”（sink effect）担忧。

讨论与展望

本研究成功开发了一种新型的、具有高度选择性的三特异性TCE平台——TriMab。它通过巧妙的分子设计，将突触门控、亲和力优化和空间几何调控相结合，为解决TCE在实体瘤应用中的核心障碍——on-target, off-tumor毒性——提供了一个强大且可推广的解决方案。与传统的双靶点TCE或“分裂式TCE”策略相比，TriMab的单分子特性、良好的可开发性（developability）及类似单抗的药代动力学特性，使其更具临床转化潜力。未来的工作将集中于探索更多有前景的TAA组合，优化锚定臂的选择标准，并在更复杂的临床前模型（如人源化小鼠或非人灵长类动物）中进一步评估其安全性和有效性。总之，TriMab平台为代表的新一代逻辑门控TCEs，为开发更安全、更有效的实体瘤免疫疗法开辟了新的道路。