中华拟鲈（Tephrinectes sinensis）的完整线粒体基因组及其与拟鲈科（Paralichthyidae）的系统发育关系

《Mitochondrial DNA Part B》：The complete mitochondrial genome of Tephrinectes sinensis and its phylogenetic position relative to Paralichthyidae

平鲉目物种Tephrinectes sinensis的完整线粒体基因组首次测序，揭示其单系群地位并支持形态学分类争议。基因组共17366bp，包含13种蛋白质编码基因、22种tRNA及2种rRNA。系统发育分析显示该物种独立于Paralichthyidae其他属，验证形态学提出的亚目分类假说。基因组资源为平鲉目系统发育研究提供基础。

　　在海洋生物分类学中，一些物种因其独特的形态特征而引发长期的分类争议。其中，Tephrinectes sinensis，一种中国沿海特有的比目鱼，就是这样一个例子。该物种因其显著的双侧不对称性、侧扁的椭圆形身体结构以及左眼位置的特征而显得尤为特殊。这些形态学上的独特性使得其在分类学上难以归入已知的比目鱼科（Paralichthyidae）中，从而引发了关于其系统发育位置的持续讨论。为了深入探讨这一问题，科学家们首次完成了该物种的完整线粒体基因组测序与注释，为理解比目鱼的进化关系提供了新的视角。

### 线粒体基因组的结构与特征

Tephrinectes sinensis的线粒体基因组呈现出典型的圆形结构，全长为17,366个碱基对（bp）。这一基因组包含13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个转运核糖核酸（tRNA）基因、两个核糖体核糖核酸（rRNA）基因以及一个非编码调控区域。这些基因和非编码区域共同构成了线粒体基因组的核心功能单元，负责能量代谢、细胞呼吸以及遗传信息的传递。值得注意的是，线粒体基因组的结构在不同物种之间具有高度的保守性，尤其是在比目鱼类中，这种保守性可能反映了其进化过程中对特定生理功能的适应。

从碱基组成来看，T. sinensis的线粒体基因组表现出一定的偏倚性。腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的含量较高，分别达到28.61%和27.28%，而鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的含量相对较低，分别为16.67%和27.44%。整体的GC含量为44%，这一数值在比目鱼类中属于正常范围，但与某些其他鱼类相比略有不同。这种碱基组成的差异可能与物种的进化历史、基因组的突变模式以及环境适应性有关。

线粒体基因组的双链结构在功能上表现出一定的不对称性。在H链上，编码了28个基因单元，包括12个蛋白质编码基因、14个tRNA基因以及两个rRNA基因的簇。而在L链上，仅编码了9个基因单元，其中包含一个蛋白质编码基因（ND6）和8个tRNA基因。这种不对称的基因分布是线粒体基因组的普遍特征，通常与基因的转录方向和复制机制相关。此外，tRNA基因的长度范围在67至75 bp之间，显示出一定的变异性，而rRNA基因则表现出明显的长度差异，rrnL基因长度为1730 bp，rrnS基因长度为982 bp。rRNA基因的GC含量也有所不同，rrnL为42.83%，rrnS为47.76%。这些特征可能与物种的代谢需求和基因表达调控机制相关。

线粒体基因组中还包含一个长度为1037 bp的非编码调控区域，该区域可能对应于经典的位移环（D-loop）结构。D-loop是线粒体基因组中负责复制起点和转录调控的关键区域，其GC含量为36.16%，这一数值低于整个基因组的平均水平。非编码区域的GC含量较低可能与其AT富集的特性有关，这种特性在许多鱼类中普遍存在，尤其是在进化过程中经历了快速分化或适应性变化的物种中。非编码区域的长度和GC含量的变化可能反映了物种在进化过程中对线粒体复制机制的调整，或者与特定的生态适应性相关。

### 系统发育分析与分类学争议

为了进一步探究T. sinensis的系统发育位置，研究人员利用最大似然法（maximum-likelihood）对其线粒体基因组进行了系统发育分析。在该分析中，T. sinensis被置于一个单系分支中，该分支作为整个Paralichthyidae科的姐妹群，而不是嵌套在任何一个已知的属内。这一结果与长期存在的形态学分类争议相吻合，即Hoshino和Amaoka（1998）通过比较尾部结构和解剖学特征，提出将T. sinensis重新归类到比目鱼亚目（Pleuronectoidei）中。他们的研究认为，T. sinensis的某些形态特征，如明显的双侧不对称性和独特的视觉器官分布，表明其可能与传统的Paralichthyidae科存在一定的差异。

这一系统发育分析的结果为分类学争议提供了分子层面的证据支持。然而，线粒体基因组的单系性并不能完全排除核基因组中的分歧。因此，研究人员指出，未来需要结合核基因组数据，以更全面地评估T. sinensis的分类地位。此外，该研究还揭示了Paralichthyidae科内部的分化模式，即不同分支之间的分化深度不均，某些属之间的亲缘关系较为紧密，而其他属则呈现出较远的分化趋势。这种分化模式可能反映了比目鱼科在进化过程中经历的复杂历史，包括多次的适应性变化和生态位分化。

值得注意的是，尽管T. sinensis与Paralichthyidae科的其他成员存在显著的系统发育差异，但其线粒体基因组的结构仍然保持了一定的保守性。这种保守性可能与比目鱼类的共同祖先特征有关，同时也可能暗示了某些关键的进化创新，如眼睛迁移和椎骨不对称性等，这些特征在比目鱼的适应性进化中具有重要作用。研究人员推测，这种保守的基因组结构可能与比目鱼类的某些生理机制相协调，例如能量代谢效率的维持和细胞呼吸功能的稳定性。

### 分类学意义与研究价值

T. sinensis的完整线粒体基因组为比目鱼的系统发育研究提供了重要的基础数据。作为首个被测序的该物种线粒体基因组，它不仅填补了比目鱼类基因组数据的空白，还为后续的多基因组、多物种的系统发育分析提供了可靠的参考。此外，该基因组的结构特征也为理解比目鱼的进化历史提供了新的线索，尤其是在探讨其分类地位和与其他比目鱼类的亲缘关系方面。

在比目鱼类中，线粒体基因组的结构和组成往往与物种的适应性特征密切相关。例如，某些比目鱼的线粒体基因组中存在特殊的基因排列或调控区域，这些特征可能与它们独特的生理机制和生态适应性有关。通过比较不同比目鱼类的线粒体基因组，科学家们可以识别出那些在进化过程中经历了显著变化的基因区域，并进一步探讨这些变化背后的生物学意义。

此外，线粒体基因组的单系性可能为比目鱼类的系统发育研究提供了一个新的视角。在传统的分类体系中，比目鱼类的系统发育关系往往基于形态学特征，而这些特征在某些情况下可能存在一定的误导性。例如，某些比目鱼的形态特征可能由于趋同进化而相似，导致分类上的混淆。而线粒体基因组的分子数据则能够提供更为精确的分类依据，因为它反映了物种的遗传分化和进化历史。因此，T. sinensis的线粒体基因组不仅有助于厘清其分类地位，还可能为比目鱼类的系统发育研究提供新的分子标记。

### 研究方法与技术细节

为了获得T. sinensis的完整线粒体基因组，研究人员采用了Illumina HiSeq 2500平台进行高通量测序。该平台以其高通量、高精度和快速的数据处理能力而著称，是目前基因组研究中最常用的技术之一。在实验过程中，研究人员首先对T. sinensis的肌肉组织进行了DNA提取，随后构建了350 bp插入片段的DNA文库，并进行了高质量的配对末端测序。初步的测序数据总量达到了10.90 Gb，经过质量过滤后，保留了10.28 Gb的有效数据。

为了提高基因组组装的准确性，研究人员采用了多种生物信息学工具进行分析。首先，他们使用BWA-MEM v0.7.17将过滤后的高质量读取数据（77,061,272对末端序列）比对到参考基因组（Paralichthys olivaceus，GenBank: AB028664），以确保数据的准确性。随后，他们利用SPAdes v4.10对数据进行了从头组装（de novo assembly），并使用了扩展的k-mer范围（21–127）以提高组装的完整性。最终，研究人员得到了一个全长为17,366 bp的线粒体基因组草图，其中包含了所有37个标准的线粒体基因单元。这一结果表明，基因组组装过程中没有受到参考基因组的偏倚影响，也没有出现样本污染的问题。

为了进一步提高基因组的准确性和完整性，研究人员对组装结果进行了两次校正（polishing），使用Pilon v1.24工具进行错误修正。随后，他们通过多步骤的注释流程对基因组进行了详细的分析，包括结构预测（MITOS2和MiTFi）、同源搜索（NCBI BLAST+ v2.28）、基因预测（GeneWise）以及结构RNA检测（Infernal v1.1）。所有注释结果均在Geneious Prime v2024.0.7中进行了人工校对，以确保注释的准确性。此外，研究人员还通过重新比对原始读取数据到最终的基因组组装结果，验证了基因组的覆盖深度，并使用SAMtools v1.16.1和ggplot2工具对覆盖深度进行了可视化分析。

### 分类学争议的延续与未来研究方向

尽管T. sinensis的线粒体基因组分析为其分类地位提供了分子层面的支持，但这一结果并不能完全解决分类学上的争议。一方面，线粒体基因组的单系性可能反映了该物种在进化过程中与其他比目鱼类的分化，但另一方面，它也可能受到核基因组的干扰。因此，研究人员建议，未来应结合核基因组的数据进行更全面的分类学分析，以判断T. sinensis的分类地位是否具有物种级别的分化特征，还是仅仅反映了线粒体与核基因组之间的不一致。

此外，研究人员还指出，尽管线粒体基因组的结构在比目鱼类中具有一定的保守性，但其非编码区域的长度和GC含量的变化可能反映了物种在进化过程中对特定生态条件的适应。例如，某些比目鱼的非编码区域可能与能量代谢的调控机制有关，而这些机制可能在不同物种中呈现出不同的演化路径。因此，T. sinensis的非编码区域可能成为研究其适应性进化的重要切入点。

### 研究的伦理与数据共享

在实验过程中，研究人员严格遵守了中国关于动物福利和科研的法律法规，并获得了Lishui大学动物研究伦理委员会的批准（批准号：LSU-AREC-202412009）。该批准确保了实验过程中的动物处理符合伦理标准，同时也遵循了中国实验室动物科学协会以及美国国立卫生研究院（NIH）的动物护理与使用委员会（IACUC）的相关规定。此外，研究人员还遵循了ARRIVE指南，以确保实验设计的透明性和可重复性。

为了促进科学研究的开放性和可重复性，研究人员将T. sinensis的线粒体基因组序列数据上传至GenBank数据库，并获得了访问编号PV021852。此外，相关的生物项目（BioProject）编号为PRJNA1215796，SRA编号为SRR32129885，Biosample编号为SAMN46419712。这些数据的公开共享不仅有助于其他研究者进行进一步的分析，也为比目鱼类的系统发育研究提供了重要的资源。

### 研究的展望与意义

T. sinensis的完整线粒体基因组不仅为比目鱼类的分类学争议提供了新的证据，也为理解比目鱼的进化机制提供了重要的基础。通过比较不同比目鱼类的线粒体基因组，科学家们可以识别出那些在进化过程中经历了显著变化的基因区域，并进一步探讨这些变化对物种适应性的影响。此外，该研究还为后续的多基因组、多物种的系统发育分析提供了可靠的参考，有助于构建更全面的比目鱼类系统发育树。

在未来的研究中，科学家们可以进一步探索T. sinensis的核基因组，以评估其分类地位是否具有物种级别的分化特征。此外，还可以结合其他分子标记，如微卫星序列、单核苷酸多态性（SNPs）以及全基因组数据，以更全面地理解比目鱼类的进化历史。这些研究不仅有助于解决分类学上的争议，还可能揭示比目鱼类在进化过程中经历的关键适应性变化，如眼睛迁移、椎骨不对称性以及独特的形态特征。

总之，T. sinensis的完整线粒体基因组为比目鱼类的系统发育研究提供了重要的分子标记，同时也为理解其分类地位和进化机制提供了新的视角。随着更多比目鱼类基因组数据的积累，科学家们有望构建一个更加精确和全面的系统发育框架，以揭示比目鱼类在进化过程中的复杂历史和适应性变化。这一研究不仅具有重要的科学价值，也为未来的分类学和进化生物学研究提供了重要的数据支持。