胚胎血管发育中内皮亚型涌现与细胞周期调控在动静脉特化中的关键作用

本刊推荐：为解决胚胎血管发育中动静脉特化机制不明的问题，Aragon等开展内皮细胞(EC)单细胞转录组与细胞周期状态整合研究，发现血流前动脉EC富集于晚G1期而静脉EC富集于早G1期，证实细胞周期抑制剂p27缺失会破坏动静脉发育，为血管疾病治疗提供新靶点。

　　

在血管发育的奇妙世界中，内皮细胞如何精准分化为动脉、静脉和毛细血管亚型，形成功能各异的循环网络，一直是发育生物学领域的关键谜题。虽然研究表明血流介导的细胞周期调控在出生后血管生成中起重要作用，但胚胎期血流尚未启动时，细胞周期状态是否以及如何影响最早期的动静脉特化，仍是不解之谜。解开这一谜题不仅有助于理解生命最初的血管构建蓝图，更为干细胞定向分化、组织工程和血管疾病治疗提供理论基石。近日发表在《Cell Reports》的研究通过多组学整合分析，揭示了胚胎内皮细胞特化过程中细胞周期状态的动态图谱及其关键调控机制。

研究主要采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)、Fucci2细胞周期报告系统、免疫组织化学、光片显微镜三维成像和基因敲除等技术手段。通过对E8.0(血流前)、E8.5(血流后)和E9.5时间点C57BL/6小鼠胚胎内皮细胞的系统分析，结合功能验证实验，构建了胚胎内皮发育的时空图谱。

单细胞分析揭示发育中的胚胎内皮细胞特性

通过scRNA-seq对6,550个CD31⁺CD45^-内皮细胞的分析，研究人员鉴定出五类内皮亚群：原始内皮细胞、静脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞、动脉内皮细胞和生血内皮细胞。这些亚群通过特征基因表达得以区分：原始细胞高表达Etv2；静脉细胞标志物为Nr2f2、Ephb4和Nrp2；毛细血管细胞表达Car2和Selenop；动脉细胞表达Nrp1、Unc5b、Gja5、Dll4等；生血内皮细胞表达Mecom、Meis2和Runx1。随时间推移，内皮亚群比例发生显著变化：E8.0时毛细血管内皮占75%，原始内皮占23%；至E9.5时动脉内皮升至20%，静脉内皮升至30%，而生血内皮占7%。伪时间分析显示动脉和生血内皮处于中高伪时间状态，静脉内皮伪时间最高，提示静脉分化晚于动脉。特别值得注意的是，细胞周期相关通路随着伪时间进展显著富集，动脉内皮显示细胞周期阻滞评分升高，而静脉内皮显示细胞周期进程评分增加，提示细胞周期调控与内皮特化存在内在关联。

不同细胞周期状态下内皮细胞的差异基因表达

利用R26p-Fucci2报告小鼠，研究人员将内皮细胞分选为早G1期(无荧光)、晚G1期(红核)和S/G2/M期(绿核)进行批量RNA测序。分析发现3,299个差异表达基因：S/G2/M期富集增殖相关通路；早G1期富集Wnt和MAPK信号通路、细胞极性和管形成相关基因；晚G1期富集Notch和NF-κB信号通路及蛋白糖基化相关基因。通过将批量RNA-seq数据与单细胞数据整合，发现静脉内皮与早G1期转录谱高度一致，动脉内皮与晚G1期谱系对齐，而生血内皮也富集于晚G1期，证实细胞周期状态与内皮身份存在特异性关联。

发育胚胎中的内皮细胞周期状态

通过Fucci2胚胎切片成像和ERG染色，量化了背主动脉(DA)、静脉窦(SV)和主静脉(CV)的内皮细胞周期分布。发现早在E8.0血流前，DA内皮就显著富集于晚G1期(48.5%)，SV富集于早G1期(55.9%)，两者S/G2/M期比例相近(约38%)。随时间推移，E8.5至E10.5期间DA始终保持晚G1期富集，而CV(静脉)保持早G1期富集，且S/G2/M期细胞比例逐渐下降。颅内侧颈动脉和体节血管分析进一步验证了动脉内皮晚G1期富集、静脉内皮早G1期富集的普遍规律，表明细胞周期状态的内皮异质性是胚胎血管发育的固有特征。

内皮细胞周期调控是动静脉特化所必需的

为验证细胞周期调控的功能必要性，研究构建了内皮特异性诱导敲除细胞周期抑制剂Cdkn1b(p27)的小鼠模型(p27f/f Cdh5-CreERT2)。p27通过抑制CDK4/6阻滞G1-S期转换，促进晚G1期停滞。在E7.5-8.5诱导p27缺失后，E9.5胚胎显示血管发育受损：免疫染色显示内皮增殖(pHH3⁺)增加、凋亡(cleaved caspase-3⁺)升高；光片显微镜三维成像显示血管直径减小、密度增高、迂曲度增加和分支点增多，提示细胞周期失控导致血管过度增生和重塑障碍。通过p27ECiKO;Fucci2胚胎切片证实，p27缺失后DA和CV的晚G1期内皮显著减少，而早G1期和S/G2/M期细胞增加。分子水平上，RT-qPCR显示p27缺失胚胎中原始/不成熟标志基因(Esam、Vwf、Cdh5)表达升高，而动静脉特化基因(动脉：Efnb2、Nrp1、Gja4、Sox17；静脉：Ephb4、Nrp2、Nr2f2)显著下调，表明内皮细胞周期紊乱直接破坏动静脉特化。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示胚胎血管发育最早阶段（血流前）动静脉内皮就已富集于 distinct 细胞周期状态：动脉内皮偏向晚G1期，静脉内皮偏向早G1期，这与出生后血管生成模式相似，提示细胞周期调控是动静脉特化的保守机制。功能上，p27介导的细胞周期控制是胚胎动静脉特化和血管重塑的必要条件。机制上，早G1期富集Wnt信号可能促进静脉特化，晚G1期富集蛋白糖基化可能调控动脉命运，这为干细胞定向分化提供了潜在靶点。研究的发现不仅深化了对发育生物学基本规律的理解，更对肿瘤血管生成、肺动脉高压、糖尿病视网膜病变等血管增生性疾病治疗具有重要启示意义：通过重设内皮细胞周期状态可能恢复血管正常结构和功能，这为FDA已批准的细胞周期药物老药新用提供了理论依据。