内肽酶介导大肠杆菌侧壁肽聚糖单链插入机制及其在维持杆状形态中的关键作用

本刊推荐：为解决细菌形态维持的机制问题，研究人员开展内肽酶在肽聚糖侧壁扩张中作用的研究，发现内肽酶缺失导致杆状向球状形态转变，并通过稳定同位素标记质谱技术证明内肽酶介导新合成聚糖链以"单链插入"模式整合到现有肽聚糖网格中，揭示了细菌形态建成的分子基础。

　　

在微生物学研究领域，细菌如何维持其特定形态一直是个引人入胜的科学谜题。就像建筑师需要精确的蓝图和材料来构建建筑物一样，细菌需要精确调控其细胞壁的合成来维持形态。对于大肠杆菌这样的杆状细菌来说，其典型的杆状形态主要由肽聚糖（PG）细胞壁决定，这种巨大的大分子结构能够抵抗细胞质的膨压。然而，侧壁以恒定直径扩展的分子机制至今仍不清楚。

肽聚糖的组装涉及糖基转移酶（聚合聚糖链）和转肽酶（形成肽间交联）的协同作用。传统观点认为，内肽酶通过切割现有的肽聚糖交联，为新合成的聚糖链插入提供空间，这对于维持杆状形态至关重要。但是最近的研究对这一观点提出了挑战，发现通过过量表达溶菌转糖基酶MltD（切割糖苷键而非酰胺键）可以弥补内肽酶缺失带来的生长缺陷，这使得内肽酶在肽聚糖合成中的必要性受到质疑。

为了解决这一争议，研究人员在《Cell Reports》上发表了最新研究成果，通过构建一种条件性表达MltD且缺失全部八个内肽酶基因的大肠杆菌突变体，结合高分辨率质谱分析和荧光标记技术，深入探究了在完全缺乏内肽酶的情况下肽聚糖扩张的机制。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先利用基因工程技术构建了缺失所有内肽酶基因的大肠杆菌突变株（Δ8ED）及其各种衍生株；其次采用稳定同位素（¹³C和¹⁵N）标记技术对肽聚糖进行代谢标记，并通过高分辨率质谱分析来追踪新合成肽聚糖的整合模式；此外还使用荧光D-丙氨酸类似物（HADA）标记技术来可视化肽聚糖合成的活跃区域；最后通过全基因组测序验证突变株的基因型并排除补偿性突变的存在。所有实验均包含至少三次生物学重复以确保结果的可靠性。

MltD补偿所有内肽酶的缺失

研究人员首先成功构建了缺失所有八个内肽酶编码基因的大肠杆菌菌株（Δ8ED）。通过实验证实，MltD溶菌转糖基酶的过量表达确实能够补偿内肽酶基因的完全缺失，使菌株在缺乏所有内肽酶的情况下仍能生长。全基因组测序分析表明，在MltD过表达的情况下，Δ8ED突变体无需在肽聚糖代谢相关基因中产生任何补偿性突变就能存活。

所有内肽酶基因的缺失减少聚糖链以"单链插入"模式整合到扩展的肽聚糖中

通过稳定同位素标记和质谱分析技术，研究人员比较了野生型菌株和内肽酶缺失突变体中新合成肽聚糖的整合模式。他们特别关注了四种最丰富的由青霉素结合蛋白（PBPs）交联形成的二聚体。对于每种二聚体，质谱分析识别出三种同位素组成（同位素体）：旧→旧（两个都是标记的旧组分）、新→旧（新合成的供体与现有的受体交联）和新→新（两个都是新合成组分）。

研究发现在野生型菌株中，旧→旧二聚体主要被新→旧二聚体所取代，这符合"单链插入"的肽聚糖扩张模式。而在缺失所有内肽酶的Δ8ED pCAP40(mltD)菌株中，旧→旧二聚体主要被新→新二聚体所取代，表明"单链插入"的扩张模式受到严重损害。

MltD过表达不影响"单链插入"的肽聚糖扩张模式

为了排除MltD过表达本身对肽聚糖扩张模式的影响，研究人员比较了野生型背景下的MltD过表达株（BW25113 pCAP40(mltD)）与内肽酶缺失株的表现。发现野生型背景中MltD过表达并不改变新→旧同位素体的相对丰度（78% vs 86%），而内肽酶缺失则显著降低了这一比例（22% vs 86%），证明内肽酶确实参与"单链插入"的扩张模式。

内肽酶MepM、MepS、MepH和PBP7在"单链插入"的肽聚糖扩张模式中具有功能

研究人员进一步评估了单个内肽酶（MepM、MepS、MepH和PBP7）在维持"单链插入"模式中的功能。发现这些内肽酶单独表达时都能部分支持新→旧交联的形成（56%-67%），但需要多个内肽酶的协同作用才能达到野生型水平。

内肽酶基因缺失影响细胞形态

通过相差显微镜观察，发现产生单个内肽酶MepM的Δ8ED菌株呈现多种细胞形态缺陷，大多数细胞以长度减少的杆状形式生长。而在完全缺乏所有内肽酶的情况下，菌株主要呈现球状形态。长度与直径比值的定量分析表明，依赖MltD生长的Δ8ED菌株的比值（1.46±0.43）显著小于野生型菌株（1.88±0.51），证明侧壁伸长受损。

内肽酶基因缺失导致转肽酶活性优先定位于 septum

使用荧光D-丙氨酸类似物（HADA）标记技术，研究人员发现野生型大肠杆菌在侧壁和 septum（隔膜）都显示高荧光强度。而在仅表达MepM的Δ8ED衍生物中，侧壁标记减少。在表达MltD的Δ8ED衍生物中，HADA标记主要与 septum合成相关，表明肽聚糖合成活动从侧壁向 septum转移。

研究结论和讨论部分强调了内肽酶在维持大肠杆菌杆状形态中的核心作用。研究表明，侧壁以恒定直径扩展需要内肽酶依赖的"单链插入"机制，该机制通过协调转肽酶和内肽酶的活性来实现。内肽酶通过切割现有的肽聚糖交联，使新合成的聚糖链能够一次一个地插入到承受压力的肽聚糖层中。

这些发现提供了内肽酶参与侧壁生物合成的直接实验证据，并表明转肽酶和内肽酶可能以协调而非顺序的方式发挥作用。这种协调作用可以解释为什么Δ8ED突变体在依赖MltD生长时仍然能够存活，即使是在"先构建后断裂"的机制受到损害的情况下。

该研究的局限性在于所有实验均在大肠杆菌中进行，而在其他物种中，溶菌转糖基酶和内肽酶可能具有与肽聚糖扩张无关的功能。例如，在霍乱弧菌中，这些酶被提议通过清除未交联的聚糖链来减轻周质空间的拥挤。

这项研究不仅增进了我们对细菌形态维持机制的理解，也为开发针对细菌细胞壁合成的新型抗菌策略提供了重要见解。通过揭示内肽酶在肽聚糖合成中的关键作用，研究人员为未来针对这些酶的抗菌药物设计奠定了理论基础。