ELAVL1通过稳定HMOX1 mRNA驱动铁死亡在糖尿病视网膜病变中的作用机制研究

本研究揭示了RNA结合蛋白ELAVL1（胚胎致死异常视觉样蛋白1）通过增强HMOX1（血红素加氧酶1）mRNA稳定性，进而促进铁死亡（ferroptosis）在糖尿病视网膜病变（DR）中的关键作用。通过体内外实验证实，靶向ELAVL1-HMOX1轴可显著抑制视网膜细胞铁死亡及氧化应激，为DR治疗提供了新靶点。

　　

引言

全球糖尿病患病率的急剧上升导致糖尿病视网膜病变（DR）的发病率同步增长，对医疗系统造成重大社会经济负担。最新流行病学数据显示，目前全球有超过1.03亿人患有DR，预计到2045年将增至1.61亿。氧化应激被公认是DR的核心病理机制，其中活性氧（ROS）的过量产生触发脂质过氧化级联反应，损害视网膜结构和功能。当前DR的标准治疗干预措施包括视网膜激光光凝、玻璃体内抗血管内皮生长因子（抗VEGF）药物和玻璃体切除术，这些方法主要针对晚期血管并发症。然而，这些方法无法阻止早期神经变性或逆转已形成的血管损伤。此外，患者对抗VEGF治疗的反应不佳以及注射相关并发症进一步限制了临床疗效。这些治疗限制凸显了识别针对疾病基本机制的新型分子靶点的迫切需求。

铁死亡是一种铁依赖性调节性细胞死亡途径，以谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制和致死性脂质过氧化为特征，近年来已成为DR发病机制的关键贡献者。与凋亡或坏死不同，铁死亡直接将铁稳态失调与氧化性膜损伤联系起来，这一过程对代谢活跃的视网膜神经元、色素上皮和血管内皮尤其有害。这种机制上的区别使铁死亡抑制成为一种有前景的治疗策略，能够在DR早期进展过程中保护神经和血管组分，而当前干预措施在此阶段仍无效。

血红素加氧酶1（HMOX1）是一种应激反应酶，调节铁循环和细胞抗氧化防御，在氧化还原稳态中发挥关键作用。越来越多的证据表明，HMOX1活性升高会释放游离铁，催化Fenton反应，从而通过放大的脂质过氧化促进铁死亡 cascade。在DR背景下，视网膜HMOX1上调加剧铁 overload 和氧化应激，加速视网膜细胞的损伤和死亡。这一特性使HMOX1成为调节DR中铁死亡的一个引人注目的治疗节点。

RNA结合蛋白（RBPs）通过调节mRNA稳定性、运输和翻译，代表转录后基因表达的主要调控者，允许精确控制细胞应激反应。先前的研究揭示了在糖尿病视网膜和高糖应激的小鼠视网膜微血管内皮细胞中显著的RBP失调，包括Fus、Hnrnpa2b1、Canx和Calr。胚胎致死异常视觉样蛋白1（ELAVL1/HuR）是一种与糖尿病及相关并发症有关的RBP，可稳定许多应激反应转录本。Bresciani等人已证明ELAVL1是视网膜色素上皮稳态的重要因子，为年龄相关性黄斑变性的病理生理学提供了机制见解。关键的是，已证明ELAVL1可以结合HMOX1 mRNA 3'-非翻译区中的AU富集元件，增强其稳定性和转录水平。尽管ELAVL1参与DR的直接证据有限，但其在神经元氧化应激反应中的既定作用以及最近在视网膜疾病蛋白质组谱中的检测表明其在视网膜病理生理学中具有保守功能。

本研究调查了先前未探索的机制轴，即ELAVL1介导的HMOX1 mRNA稳定驱动DR中的铁死亡。我们假设ELAVL1通过增强HMOX1 mRNA稳定性来上调HMOX1表达，从而触发视网膜细胞铁死亡并加速DR进展。为了验证这一假设，我们将使用链脲佐菌素（STZ）诱导的DR大鼠模型和高糖应激的ARPE-19细胞机制性地剖析ELAVL1-HMOX1-铁死亡 pathway。我们的综合方法旨在评估：（1）ELAVL1/HMOX1表达与铁死亡标志物之间的时空协调；（2）ELAVL1扰动对视网膜铁死亡的功能后果；（3）靶向这一调控轴的治疗效果。通过这些研究，我们希望能识别DR发病机制中一种新的RBP调控机制，并为直接解决铁死亡的早期干预策略提供可操作的分子靶点。

方法

细胞培养与处理

成人视网膜色素上皮细胞系ARPE19（SNL-227，武汉尚恩生物科技有限公司）商业购买，并在补充了10%胎牛血清和100 U/mL链霉素-青霉素的Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国）中维持。为了建立高糖条件，基础葡萄糖浓度调整为5.5 mM（对照组）和25 mM高糖（HG）组，暴露48小时。在70%汇合度时，细胞使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商说明进行转染。转染构建体包括 knockdown 载体：靶向HMOX1的短发夹RNA（sh-HMOX1）、靶向ELAVL1的shRNA（sh-ELAVL1）和非靶向阴性对照（sh-NC），以及 overexpression 载体：ELAVL1过表达载体（oe-ELAVL1）和空载体阴性对照（oe-NC）。

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定

ARPE19细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中，并进行实验处理。干预后，加入10% CCK-8试剂，随后孵育3小时。然后使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific）在450 nm处测量光密度（OD）。

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定

使用TUNEL测定试剂盒（C1089，碧云天，中国）评估细胞凋亡。ARPE19细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，并用4%多聚甲醛固定30分钟。再次洗涤后，细胞暴露于透化溶液，并在室温下孵育5分钟。接下来，加入50 μL TUNEL反应混合物，细胞在37°C黑暗条件下孵育60分钟。核 counterstaining 使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）后，样品用抗 fade 封片剂封片。最后，在荧光显微镜下观察和成像，并使用ImageJ软件（V1.8.0.112，NIH，美国）量化TUNEL阳性细胞。

Fe2?含量测量

使用铁测定试剂盒（EEA009，Thermo Fisher Scientific）测量细胞内Fe2?水平。简要来说，细胞样品处理并与提供的比色试剂孵育。随后，使用酶标仪测定OD值以获得Fe2?的最终浓度。对于视网膜组织分析，使用试剂盒（E-BC-K304-S，Elabscience，中国）按照制造商说明量化Fe2?水平。

细胞内ROS水平测量

通过将ARPE19细胞与2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA；S0033，碧云天）孵育来量化细胞内ROS generation。用DMEM洗涤三次后，立即使用荧光显微镜捕获细胞图像。使用ImageJ软件分析相对荧光强度。

生化分析

使用SOD测定试剂盒（D799594，生工，中国）、MDA测定试剂盒（S0131S，碧云天）和ROS检测试剂盒（JL-T3037-96，江来生物技术，中国）分别按照制造商方案评估组织或细胞中的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和ROS水平。

Western Blotting（WB）

使用 radioimmunoprecipitation assay 裂解缓冲液（ab170197，Abcam，英国）从细胞中获取总蛋白。使用 bicinchoninic acid 蛋白测定试剂盒（P0010，碧云天）测量蛋白浓度。等量蛋白样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上解析，并使用湿转法电转移到聚偏二氟乙烯膜（ab133411，Abcam）上。膜用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后在4°C overnight 与以下一抗孵育：靶向ELAVL1（1:500，A1608，Sigma-Aldrich，美国）、HMOX1（1:2,000，ab189491，Abcam）、GPX4（1:1,000，ab125066，Abcam）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11；1:1,000，A13685，Abclonal，中国）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；1:2,000，ab181602，Abcam）。用含Tween 20的Tris缓冲盐水（ZS405-3，Zomanbio，中国）洗涤膜后，细胞与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（1:2,000，ab205718，Abcam）培养2小时。使用增强化学发光底物（A38554，Thermo Fisher Scientific）可视化蛋白条带，并使用ImageJ软件量化。GAPDH用作 internal control 以评估目标蛋白的相对水平。

动物处理与分组

Sprague-Dawley大鼠（8周龄，230–250 g）从维通利华实验动物技术有限公司（中国北京）购买，并在受控条件下饲养：温度维持在25 ± 5°C，相对湿度60 ± 5%，12小时光/暗循环，自由获取食物和饮水。适应7天后，大鼠随机分配到以下实验组：对照组、STZ组、sh-NC组、sh-HMOX1组、sh-ELAVL1组、sh-ELAVL1 + oe-NC组和sh-ELAVL1 + oe-HMOX1组，每组6只大鼠。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南（第8版，2011年）进行，并经湖南循证生物技术有限公司伦理委员会批准（批准号：AB24072204）。

动物建模

通过连续5天腹腔注射60 mg/kg STZ（S0130，Sigma-Aldrich）在大鼠中诱导胰岛素缺乏性糖尿病。为了防止急性体重减轻和维持慢性高血糖，每2-3天 administration 胰岛素（0.2单位，12585014，Invitrogen，美国）。对照组大鼠腹腔注射柠檬酸盐缓冲液作为对照，持续两个月。STZ方案后连续三天血糖读数持续高于275 mg/dL确认糖尿病发作。糖尿病确认后，大鼠接受玻璃体内注射重组腺相关病毒（AAV）血清型2（选择用于视网膜趋向性）携带巨细胞病毒启动子下的表达盒。构建体包括乱序shRNA对照（sh-NC）、靶向HMOX1的shRNA（sh-HMOX1）、靶向ELAVL1的shRNA（sh-ELAVL1）、空载体对照（oe-NC）和HMOX1过表达质粒（oe-HMOX1）。每只眼注射2 μL病毒溶液，浓度为1.0 × 101?病毒基因组。注射在糖尿病诱导开始后的第二天进行，并每月重复一次以维持转基因表达。通过体内眼底成像绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和体外逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析验证视网膜转导效率。高血糖两个月后，通过腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠 euthanized 大鼠，收获视网膜组织用于进一步实验。

苏木精-伊红（HE）染色

收集的视网膜组织样品固定，石蜡包埋，并切片4 μm厚度。切片然后在二甲苯I和二甲苯II（Sigma-Aldrich）中脱蜡20分钟，随后在梯度乙醇中脱水各5分钟。用蒸馏水冲洗后，切片用苏木精染色，流水冲洗，然后用伊红 counterstained。用蒸馏水冲洗多余伊红后，切片在梯度乙醇中脱水，二甲苯透明，并用中性树脂封片。在光学显微镜（CX43，Olympus，日本）下观察细胞形态，以评估大鼠视网膜组织的病理变化。

免疫组织化学（IHC）

组织切片置于40°C水浴中以避免气泡影响组织。脱蜡后，切片用蒸馏水洗涤，然后浸入3%过氧化氢中以阻断内源性过氧化物酶活性。通过将切片在柠檬酸盐缓冲液中孵育进行抗原修复，随后微波加热3分钟，冷却至室温，并重新加热以确保充分暴露抗原位点。抗原修复后，进行非特异性结合阻断。切片然后在4°C overnight 与针对HMOX1（1:20,000，ab189491，Abcam）和ELAVL1（1:100，A1608，Sigma-Aldrich）的一抗孵育。洗涤后，切片与HRP标记的山羊抗兔二抗（1:2,000，ab205718）孵育1小时。随后，使用3,3'-二氨基联苯胺工作溶液（P0203，碧云天）进行显色，随后苏木精 counterstaining。在光学显微镜（CX43）下观察染色结果。使用ImageJ软件量化细胞（阳性面积/总面积 × 100% = 相对阳性面积）。

RT-qPCR测定

使用快速RNA提取试剂盒（DP419，嘉初生物科技有限公司，中国）从组织和细胞中分离总RNA。随后，使用荧光定量PCR检测试剂盒（QR0100，Sigma-Aldrich）进行RT-qPCR。GAPDH用作 internal reference gene，并使用2?ΔΔCt方法计算相对mRNA水平。引物序列列于表1。

放线菌素D转录抑制测定

为了评估HMOX1 mRNA稳定性 dynamics，ARPE19细胞暴露于HG条件或进行ELAVL1 knockdown，随后用100 ng/mL放线菌素D（50–76-0，MedChemExpress，美国）处理。在处理后0、6、12和24小时收集细胞用于总RNA提取。进行RT-qPCR以分析HG或ELAVL1 knockdown对HMOX1 mRNA稳定性的影响。

RNA免疫沉淀（RIP）

实验条件下的ARPE19细胞使用裂解缓冲液裂解，并收集上清液供进一步使用。RIP按照免疫沉淀试剂盒与蛋白A + G磁珠的说明进行。简要来说，500 μL抗ELAVL1抗体（1:30，ab200342，Abcam）或免疫球蛋白G（IgG）工作溶液与20 μL蛋白A + G磁珠在室温下孵育1小时，以获得包被抗ELAVL1抗体或IgG的磁珠。收集的上清液然后与抗体包被的磁珠混合，并在4°C overnight 孵育。之后，将混合物放在磁架上10秒以分离磁珠，随后去除上清液。洗脱结合的mRNA并逆转交联，随后收集mRNA用于RT-qPCR分析。

RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）结合免疫荧光（IF）

细胞在4%多聚甲醛中固定，并用0.1% Triton X-100（9036–19-5，Sigma-Aldrich）透化。使用针对HMOX1 mRNA的荧光标记探针进行RNA-FISH。预杂交后，加入探针混合物并在适当温度下孵育足够时间以允许与HMOX1 mRNA结合。RNA-FISH后，细胞用PBS洗涤并进行IF染色。将针对ELAVL1的一抗（SAB5700123，Sigma-Aldrich）应用于细胞，室温下1小时，随后与Alexa Fluor标记的二抗（ab150079，Abcam）在室温下孵育1小时。DAPI用于核 counterstaining。染色程序后，样品用封片剂封片。使用荧光显微镜观察RNA-FISH信号（HMOX1 mRNA的荧光信号）和IF信号（ELAVL1蛋白的荧光信号）。使用ImageJ软件分析ELAVL1蛋白和HMOX1 mRNA在细胞内的共定位。

统计方法

使用GraphPad Prism 9（Dotmatics，美国）进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性。两组之间的比较使用Student’s t检验执行，而单向方差分析（ANOVA）用于评估三个或更多组之间的显著性，随后进行Tukey’s post hoc检验。

结果

铁死亡介导DR发病机制

为了模拟糖尿病视网膜病理，ARPE19细胞暴露于HG条件。结果显示，HG处理显著降低细胞活力，这一效应被铁死亡抑制剂 ferrostatin-1（Fer-1）共处理逆转。进一步的TUNEL测定证实HG诱导的ARPE19细胞凋亡，同样被Fer-1减弱。生化分析显示，HG增加细胞内Fe2?水平，升高ROS production，增加脂质过氧化标志物MDA含量，并降低抗氧化酶SOD活性在ARPE19细胞中，表明铁死亡 dysregulation 和氧化应激。然而，Fer-1处理使这些扰动正常化，减少Fe2?和ROS积累，同时减弱MDA升高并恢复SOD活性。WB分析进一步证明，铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11在HG处理后下调，Fer-1恢复这些铁死亡调节剂的表达。这些发现共同表明铁死亡是高糖诱导视网膜细胞损伤的关键机制。

HMOX1在DR大鼠中高表达

为了识别DR的分子驱动因素，我们在三个Gene Expression Omnibus（GEO）数据集GSE102485、GSE94019和GSE60436中筛选了DR中的差异表达基因（DEGs），严格阈值p值 < 0.01和log倍数变化 > 2。鉴于铁死亡在DR发病机制中的既定 involvement，我们将这些DEGs与FerrDb数据库中的铁死亡相关因子相交，识别HMOX1为唯一重叠基因。这种铁调节酶通过影响铁代谢和氧化应激水平调节铁死亡。在STZ诱导的DR大鼠模型中，HE染色显示与对照组相比，视网膜深度 disorganization。此外，IHC分析证实糖尿病视网膜中HMOX1阳性表达率显著增加 versus 对照组。这些发现暗示HMOX1可能在DR病理学中发挥重要作用，将其抑制定位为一种有前景的治疗策略。

HMOX1通过驱动铁死亡加剧HG诱导的ARPE19细胞损伤

HG暴露显著上调ARPE19细胞中HMOX1表达在mRNA和蛋白水平。为了进一步研究HMOX1的功能作用，我们使用三个独立的sh-HMOX1进行HMOX1 knockdown。RT-qPCR和WB结果显示，sh-HMOX1-3表现出最佳 knockdown 效率，并被选择用于后续实验。CCK-8测定证明，与sh-NC组相比，HMOX1 knockdown 部分恢复高血糖诱导的细胞活力。TUNEL染色确认HMOX1 knockdown 后凋亡显著减少。关键的是，铁死亡生物标志物被深刻调节：细胞内Fe2?水平、ROS积累和MDA含量显著降低，而SOD活性在HMOX1 knockdown 后显著增加。WB结果进一步显示，与sh-NC组相比，GPX4和SLC7A11在sh-HMOX1组中显著上调。这些数据表明，抑制HMOX1通过铁死亡 potentiation 减少视网膜细胞损伤，将其定位为DR的治疗靶点。

HMOX1在体内驱动铁死亡介导的DR病理学

为了建立HMOX1抑制在体内DR中的治疗潜力，我们在STZ诱导的DR大鼠中 administration 玻璃体内sh-HMOX1。RT-qPCR和IHC确认sh-HMOX1组视网膜组织中 robust HMOX1 knockdown。HE染色显示，与sh-NC组相比，sh-HMOX1处理的视网膜显著组织学 preservation。生化分析显示，HMOX1抑制 substantially 减弱铁死亡生物标志物，减少视网膜Fe2?、MDA和ROS水平，同时增加SOD活性。在分子水平上，WB分析证明，与sh-NC组相比，sh-HMOX1组GPX4和SLC7A11表达增加，表明HMOX1 knockdown 后铁死亡 inhibited。这些结果 establish HMOX1通过铁死亡激活促进DR进展，并验证其靶向作为一种疾病修饰策略。

ELAVL1增强HMOX1 mRNA稳定性

鉴于RBPs在DR发病机制中的既定作用，我们查询ENCORI数据库以寻找调节HMOX1的RBPs。与铁死亡相关蛋白的交集识别了两个候选者：ELAVL1/HuR和SRY-box转录因子2（SOX2）。ELAVL1，一种N?-甲基腺苷（m?A）阅读器蛋白，已知可增强mRNA稳定性，由于其未定义的在DR期间HMOX1调节中的作用而被优先考虑。在STZ诱导的DR大鼠中，视网膜ELAVL1表达在mRNA和蛋白水平上增加 versus 对照组。类似地，HG在ARPE19细胞中升高ELAVL1表达，暗示ELAVL1在高糖应激反应中。Knockdown 筛选识别sh-ELAVL1-1为最佳，同时减少HMOX1 mRNA和蛋白表达。放线菌素D追逐测定显示，sh-ELAVL1组中HMOX1 mRNA的半衰期显著缩短，表明ELAVL1增强HMOX1 mRNA稳定性。此外，RNA-FISH结合IF确认ELAVL1蛋白和HMOX1 mRNA的显著共定位，支持ELAVL1和HMOX1之间的相互作用。RIP测定验证ELAVL1直接结合HMOX1 mRNA，建立ELAVL1作为DR中HMOX1的直接转录后调节者。

ELAVL1通过HMOX1 mRNA稳定驱动铁死亡

为了建立功能因果关系，我们在ELAVL1耗尽的ARPE-19细胞中在HG下进行救援实验。虽然sh-ELAVL1减少HMOX1表达，但伴随的HMOX1过表达（oe-HMOX1）恢复其表达而不改变ELAVL1表达。这种分子救援消除了ELAVL1 knockdown 的细胞保护效应，降低细胞活力并增加细胞凋亡 versus sh-ELAVL1对照组。铁死亡生物标志物镜像这一逆转：细胞内Fe2?含量、ROS积累和MDA水平显著增加，而SOD活性在HMOX1过表达后降低，表明HMOX1恢复后铁死亡和氧化应激增强。此外，GPX4和SLC7A11表达在HMOX1过表达后下降。这些结果表明，HMOX1恢复逆转ELAVL1 knockdown 介导的铁死亡保护，建立ELAVL1-HMOX1作为驱动糖尿病中视网膜细胞铁死亡的明确调控轴。

体内验证ELAVL1-HMOX1-铁死亡轴

为了进一步验证翻译相关性，我们通过组合玻璃体内递送sh-ELAVL1和oe-HMOX1在DR大鼠中进行救援实验。sh-ELAVL1显著减少ELAVL1和HMOX1表达 versus sh-NC组。关键的是，oe-HMOX1恢复HMOX1表达而不拯救ELAVL1抑制。HE染色显示，sh-ELAVL1保留视网膜结构，表现出更规则的细胞排列和减少的组织损伤，与sh-NC组相比。这种保护被HMOX1重组废除，oe-HMOX1诱导比sh-ELAVL1 + oe-NC组更大的光感受器 disorganization。铁死亡生物标志物镜像这一逆转，减少视网膜Fe2?水平，而oe-HMOX1增加Fe2?水平 versus sh-ELAVL1 + oe-NC组。氧化应激参数进一步确认 pathway 依赖性。sh-ELAVL1降低MDA和ROS同时升高SOD活性，表明ELAVL1 knockdown 减轻氧化应激。HMOX1恢复逆转这些增益，增加MDA和ROS水平同时抑制SOD活性。铁死亡相关蛋白的WB分析显示，sh-ELAVL1上调GPX4和SLC7A11，效应被oe-HMOX1共表达废除。这些数据 conclusively 证明ELAVL1通过HMOX1稳定驱动DR中的铁死亡，HMOX1重组废除ELAVL1靶向保护。

讨论

积累的证据表明，HMOX1由于其