番茄SICAK1 Ser60磷酸化调控细菌冷休克蛋白诱导的免疫新机制

本刊推荐：为阐明植物识别细菌冷休克蛋白csp22后的免疫信号传导机制，研究人员聚焦番茄受体样胞质激酶SICAK1的功能解析。研究发现SICORE-SIBAK1a受体复合物在感知csp22后招募SICAK1，并通过特异性磷酸化其N端Ser60位点激活下游免疫应答。该发现不仅揭示了Solanaceae植物特有的免疫激活机制，还为作物抗病育种提供了新靶点。

　　

植物在长期进化过程中形成了复杂的免疫系统来抵御病原微生物侵袭。细胞表面的模式识别受体（PRRs）能够感知微生物或损伤相关分子模式（MAMPs或DAMPs），从而激活模式触发免疫（PTI）。细菌冷休克蛋白（CSP）中包含一个高度保守的22氨基酸肽段（csp22），被证实是Solanaceae植物特有的免疫原性分子。番茄冷休克蛋白受体（SICORE）作为富含亮氨酸重复序列的受体样激酶（LRR-RLK），负责识别来自青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的csp22肽段。虽然已知SICORE与共受体SIBAK1a形成复合物传递csp22触发的免疫信号，但细胞质内的信号调控机制仍不清楚。

发表在《Cell Reports》的这项研究通过转录组分析发现，番茄受体样胞质激酶SICAK1（Solyc09g061330）在青枯病菌感染后显著上调表达。研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了sicak1突变体，发现突变体植株的csp22诱导活性氧（ROS）爆发、MAPK磷酸化和胼胝质沉积等免疫反应显著减弱，对青枯病的抗性明显下降。相反，过表达SICAK1的番茄植株不仅增强了对csp22的免疫反应，还提高了对青枯病的抗性，且不影响植株生长发育和果实产量。

研究采用病毒诱导基因沉默（VIGS）、农杆菌介导的毛根转化、免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）、体外激酶 assay 和磷酸化蛋白质组学等技术方法。样本包括番茄栽培种Hawaii 7996和Moneymaker，本氏烟突变体Nbbak1，以及青枯病菌株GMI1000和UW551。

SICAK1 contributes to tomato resistance to bacterial wilt and csp22-induced immune responses

研究人员通过转录组分析鉴定了5个青枯病菌感染后显著上调的RLCK VII亚家族基因，其中Solyc09g061330（命名为SICAK1）沉默后显著抑制csp22诱导的ROS爆发。利用CRISPR/Cas9技术构建的sicak1突变体在叶片和根中均表现出csp22诱导的ROS爆发缺陷，MAPK磷酸化水平显著降低，胼胝质沉积减少约70%。接种青枯病菌后，突变体植株出现更严重的萎蔫症状，茎部细菌载量提高6倍。GFP标记的病原菌观察发现突变体植株木质部中病原菌移动能力增强。此外，sicak1突变体中青枯病菌诱导的ROS积累减少50%。

SICAK1 globally regulates csp22-induced immune gene expression

转录组分析显示，csp22处理后在野生型中鉴定到1903个差异表达基因（DEGs），而sicak1突变体中仅发现687个DEGs。比较分析发现1043个上调基因和736个下调基因为野生型特有。GO富集分析表明这些基因主要参与生物刺激响应、防御反应、水杨酸（SA）响应以及乙烯（ET）和木质素代谢过程。RT-qPCR验证发现sicak1突变体中SISARD1（SA生物合成）、SIETR（ET信号）、SIPR3（几丁质酶）和SIMYB15（木质素生物合成）等关键免疫基因的诱导表达显著减弱。组织化学染色证实sicak1突变体中青枯病菌和csp22诱导的木质素积累明显减少。

SICAK1 is recruited to the SICORE-SIBAK1a complex and phosphorylated by SIBAK1a

亚细胞定位显示SICAK1定位于细胞膜。免疫共沉淀结果表明csp22处理3分钟后SICAK1-HA能被SICORE-FLAG免疫沉淀，10分钟后解离。SICAK1与SIBAK1a也呈现类似的瞬时相互作用模式。BiFC实验进一步验证了SICAK1与SICORE/SIBAK1a复合物的动态结合，csp22处理后YFP荧光信号迅速增强，15分钟后恢复至本底水平。酵母双杂交和体外pull-down实验证明SICAK1直接与SIBAK1a胞内域（SIBAK1a^CD）相互作用，而与SICORE胞内域（SICORECD）无直接相互作用。体外激酶实验表明SIBAK1a^CD能直接磷酸化SICAK1，而SICORECD虽具有自磷酸化活性，但不能磷酸化SICAK1。

Biological function of SICAK1 orthologues in N. benthamiana is conserved

在本氏烟中，csp22诱导的SICAK1磷酸化呈现时间依赖性，1分钟即可检测到，3分钟达到峰值，10分钟后减弱。在Nbbak1突变体中，SICAK1磷酸化完全消失，而回补SIBAK1a可恢复磷酸化。系统进化分析将SICAK1归类于RLCK VII-2分支。本氏烟中两个SICAK1同源基因（NbCAK1.1和NbCAK1.2）沉默后，csp22诱导的MAPK活化和ROS爆发显著减弱，接种青枯病菌后病害症状加重，细菌生长量增加。在NbCAK1沉默植株中异源表达SICAK1可完全恢复csp22诱导的免疫反应。

Phosphorylation of Ser60 in the N terminus of SICAK1 is essential for csp22 signaling

磷酸化蛋白质组学鉴定出SICAK1的6个磷酸化位点（Thr34、Ser48、Ser60、Ser266、Ser401和Ser431）。根据csp22诱导磷酸化水平超过1.5倍的标准，筛选出Ser60、Ser401和Ser431三个关键位点。Phos-tag凝胶分析显示SICAK1^S60A突变体的磷酸化水平显著降低，而S401A和S431A突变体与野生型相似。激酶活性检测表明SICAK1^S60A的自磷酸化活性和ATP水解活性未改变。互作实验证明SICAK1^S60A与SIBAK1a的相互作用与野生型无差异，但体外激酶实验显示SIBAK1a^CD不能磷酸化SICAK1^S60A。在本氏烟和番茄毛根中回补实验表明，SICAK1^S60A不能恢复csp22诱导的ROS爆发、MAPK活化和免疫基因表达。序列比对发现Ser60在Solanaceae植物中特异性保守。

研究结论表明SICAK1作为csp22信号通路的关键组分，通过被SIBAK1a特异性磷酸化其N端Ser60位点而激活，进而调控下游免疫基因表达和抗病反应。该研究揭示了RLCK激酶N端磷酸化修饰在免疫信号激活中的新机制，阐明了Solanaceae植物中csp22信号通路的独特激活方式。值得注意的是，Ser60位点的保守性仅限于Solanaceae植物，表明RLCK VII-2亚家族成员在该科植物csp22免疫信号传导中起主导作用。

讨论部分指出，与拟南芥中BIK1-FLS2/BAK1和PBL27-LYK5/CERK1等RLCK-受体复合物的动态互作模式不同，SICAK1与SICORE-SIBAK1a复合物呈现快速结合和解离的特点，这种独特的互作动力学确保了信号传导的精确调控。虽然SICORE是典型的RD型激酶且具有自磷酸化活性，但不能直接磷酸化SICAK1，这一功能由共受体SIBAK1a特异性完成。特别值得注意的是，Ser60位于N端调节元件（NRE）的丝氨酸富集区，该区域可能通过构象变化调节激酶域活性。AlphaFold 3结构预测显示，非激活状态下SICAK1的N端与SIBAK1a激酶域相互作用，Ser60磷酸化后产生的负电荷可能促使N端与SIBAK1a解离，进而促进激酶域之间的互作和转磷酸化。该研究为理解RLCK激活机制提供了新视角，同时为作物抗病育种提供了有价值的靶点。