AMI-异腈连接反应2.0版：快速、选择性且pH敏感的突破性生物正交化学工具

为解决肿瘤等酸性微环境靶向标记难题，研究人员开展基于偶极子结构优化的AMI-异腈生物正交连接研究。通过机制驱动策略同步提升氮杂甲烷亚胺(AMI)的布朗斯特碱性和亲电性，实现反应速率超100倍增长（pH 7时k=14 M-1s-1，pH 5时k>1000 M-1s-1），成功演示酸性条件下活细胞选择性标记和HER2靶向功能，为精准医学提供新型环境响应型分子工具。

　　

在化学生物学和生物医学研究领域，科学家一直致力于开发能够在活体环境中特异性标记生物分子的化学工具，即生物正交化学。这类技术允许研究人员在复杂的生理条件下进行选择性化学反应，而不会干扰正常的生物学过程。过去二十年中，生物正交反应已经从基础研究逐步走向临床应用，甚至有些基于该技术的疗法已进入临床试验阶段。然而，现有主流技术如逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应(iEDDAC)和应变促进叠氮-炔环加成(SPAAC)大多对pH变化不敏感，这限制了它们在特定微环境（如肿瘤酸性区域）中的精准应用。

肿瘤微环境通常呈现酸性（pH约6.7），与正常组织的pH（7.4）存在显著差异。这种pH差异为疾病特异性靶向提供了潜在机会，但传统pH敏感反应（如腙或肟形成）存在反应速率慢、化学选择性差以及生物分子背景干扰等问题。钾酰三氟硼酸盐(KAT)与羟胺的连接虽在酸性条件下加速，但所需pH过低难以实际应用。因此，开发兼具快速动力学、优异选择性和pH敏感性的新型生物正交反应成为迫切需求。

2013年，Wennemers团队首次报道了氮杂甲烷亚胺(azomethine imine, AMI)与异腈(isonitrile)的生物正交连接反应。该反应具有化学选择性高、连接产物稳定、异腈报告基团小等优势，且反应速率随pH降低而显著提升（pH 7时k≈0.1 M^-1s^-1，pH 4时k≈100 M^-1s^-1）。但其在生理pH下的速率仍不足以满足某些生物应用需求。基于此，研究人员通过机制驱动的理性设计对AMI偶极子进行结构优化，显著提升了反应性能。

本研究主要采用紫外-可见光谱动力学分析、核磁共振pKa测定、Hammett线性自由能关系分析、高效液相色谱监测、蛋白质液相色谱-质谱联用(LC-MS)、细胞流式术、共聚焦显微镜成像等关键技术方法。实验涉及人胚胎肾细胞(HEK293T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)、人卵巢癌细胞(SK-OV-3)和人宫颈癌细胞(HeLa)等细胞模型。

机制驱动的AMI反应性优化

通过系统改变AMI分子中酚酰基的对位取代基（从吸电子硝基到供电子二甲氨基），发现反应速率常数(k)与AMI的pKa值呈线性相关（r²=0.99）。供电子基团（如NMe₂）显著提高AMI的布朗斯特碱性，加速质子化步骤，使反应速率提升近10倍。同时发现AMI与水合形式（半酰胺）的平衡比例与反应活性正相关，可通过核磁共振快速评估AMI反应性。

AMI亲电性调控

用螺环己基替代稠合苯环增强AMI亲电性，使反应速率进一步提升。AMI 1id（螺环己基+甲氧基）与异腈2在pH 7下的k达7.4 M^-1s^-1，较第一代AMI 1ad提升70倍。Hammett分析（ρ=-0.41）表明过渡态中质子转移程度较低，亲电性增强与碱性提升产生协同效应。

叠加优化与反应特性

组合最优结构单元（螺环己基+对位二甲氨基）得到AMI 1ie，在pH 7下k=14 M^-1s^-1（较1ad提升＞120倍），并保持pH敏感性（pH 6时k=140 M^-1s^-1，pH 5时k>1000 M^-1s^-1）。连接产物在细胞裂解液和谷胱甘肽溶液中稳定性良好，但恶二嗪水解半衰期延长至40.9小时（pH 7）。

与其它连接的正交性及蛋白质标记

优化后的AMI 1ie与常见亲双烯体（环丙烯、反式环辛烯、双环壬炔）无交叉反应，但可选择性快速标记异腈修饰的泛素蛋白(Ub-NC)。在pH 5条件下10分钟内完成定量标记，pH 7时4小时转化率＞90%，媲美四嗪-TCO连接反应效率。

pH敏感细胞标记

用NHS异腈酯(6)修饰CHO-K1细胞膜后，Alexa Fluor 647标记的AMI(7)在pH 6.7下的标记强度是pH 7.4的2倍以上（流式术验证），且无背景吸附。证实0.7 pH单位差异足以实现酸性环境选择性标记。

HER2过表达癌细胞的靶向标记

将曲妥珠单抗(trastuzumab)分别功能化为异腈抗体(Ab-NC)和TCO抗体(Ab-TCO)，对比AMI-异腈连接与四嗪-TCO连接的pH依赖性。在HER2(+) SK-OV-3细胞中，pH 6.0时两种连接均实现强标记；pH 7.4时四嗪-TCO连接保持高效，而AMI-异腈连接信号降至背景水平（与HER2(-) HeLa细胞相当）。证明该反应可实现"酸性pH+肿瘤受体"双条件门控靶向。

本研究通过理性设计成功开发出第二代AMI-异腈连接反应，其速率较初代提升超100倍，同时保留优异的化学选择性和pH敏感性。反应速率在生理pH下达14 M^-1s^-1，酸性环境下超过1000 M^-1s^-1，使低微摩尔甚至纳摩尔浓度下的标记成为可能。研究人员在蛋白质标记、活细胞膜标记和肿瘤靶向等多个层面验证了该技术的实用性，特别演示了基于pH和受体表达双条件的癌症细胞选择性标记。这种环境敏感性生物正交工具为肿瘤诊断和治疗提供了新型分子策略，有望推动精准医学领域的发展。未来研究方向包括进一步优化AMI结构以平衡反应速率与产物水解动力学，以及探索在体应用如体内肿瘤成像和靶向给药等。