血清NELL-1与EXT1/2回顾性分析：在膜性肾病队列中缺乏治疗反应的预测价值

本刊推荐：本研究回顾性分析197例经活检确诊的膜性肾病（MN）患者血清NELL-1与EXT1/2抗原的预测价值。结果显示，尽管NELL-1（8.6%）与EXT1/2（6.6%）在部分患者中阳性，但其状态与蛋白尿缓解等临床结局无显著相关性，提示二者虽具诊断意义，却无法预测免疫抑制治疗（IST）或RAAS阻断疗法的疗效。

　　

摘要

神经表皮生长因子样蛋白1（NELL-1）与外生骨疣蛋白1/2复合物（EXT1/2）是近年来在膜性肾病（MN）中新发现的靶抗原，然而它们在中国人群中的流行率及临床特征仍不明确。本研究连续纳入197例经肾活检确诊的MN患者，其中包括186例特发性膜性肾病（IMN）和11例继发性膜性肾病（SMN）。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清NELL-1和EXT1/2抗原水平，并收集活检前基线数据和至少一年的随访数据进行分析。在所有参与者中，152例为抗磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体阳性，8.6%（17/197）为NELL-1抗原阳性，6.5%（13/197）为EXT1/2抗原阳性。活检后，95.4%（188/197）的患者接受了治疗：61.9%（122/188）接受了免疫抑制治疗（IST），其余仅接受肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）阻断疗法。IgG亚类分布存在显著差异，在抗PLA2R抗体阳性病例中，93.4%（142/152）以IgG4为主，而在NELL-1抗原阳性病例中58.9%（10/17）以IgG1为主，EXT1/2抗原阳性病例中84.6%（11/13）以IgG1为主。经过中位13.0个月的随访，67.5%（133/197）的患者实现蛋白尿缓解。总之，NELL-1和EXT1/2抗原的检出率分别为8.63%和6.60%，但抗原状态不能预测治疗反应或蛋白尿缓解等临床结局。

引言

膜性肾病（MN）以肾小球基底膜（GBM）中抗原-抗体复合物的存在为特征，导致补体激活、足细胞损伤以及GBM增厚和重塑。以往，MN被分为原发性和继发性，后者与自身免疫病、感染、药物或恶性肿瘤等相关。近20年来，随着在足细胞和GBM中新靶抗原的发现及其相关循环抗体的检测，对MN病理生理学的理解显著推进。2009年，Beck等人发现磷脂酶A2受体（PLA2R）在成人原发性MN患者的肾组织中与免疫球蛋白G4（IgG4）共定位，目前血清抗PLA2R抗体已用于原发性MN的诊断和治疗效果预测。2019年，神经表皮生长因子样蛋白1（NELL-1）被确定为MN的靶抗原，似乎是第二常见的抗原，约占MN病例的10%。抗NELL-1抗体主要为IgG1亚类，可在血清中检测到。NELL-1相关MN的已知病因包括恶性肿瘤、使用α-硫辛酸以及因使用印度土著药物导致的汞暴露。同一年，外生骨疣蛋白1/2复合物（EXT1/2）也被确定为与自身免疫性疾病（如狼疮）相关的MN中的潜在抗原。EXT1/2相关MN被认为与良好的临床预后和肾活检中相对较轻的慢性病变有关。尽管PLA2R是原发性MN中的主要抗原，但NELL-1和EXT1/2抗原的检测具有关键的诊断意义，有助于识别需要替代管理策略的PLA2R阴性病例，揭示潜在的恶性肿瘤或自身免疫性疾病，并防止将这些抗原阳性的继发性形式误分类为原发性MN。然而，目前大多数新抗原的临床病理信息来自相对有限的患者队列，这促使我们评估来自肾活检数据库的MN队列中这些抗原的流行率，并将这些发现与临床结局相关联。

材料与方法

这项回顾性单中心队列研究纳入2019年1月至2022年12月期间在山西医科大学第二医院肾病科接受肾活检并诊断为MN的所有连续患者。病理标本由山西省肾病病理中心评估。基于肾活检结果和纳入患者的临床特征，MN的临床诊断分为特发性膜性肾病（IMN）和继发性膜性肾病（SMN），SMN进一步包括膜性狼疮性肾炎（MLN）和未确定的不典型膜性肾病（UAMN）。临床诊断数据根据国际疾病分类第十版（ICD-10）编码从医疗记录中提取。基于肾活检队列的数据库于2015年8月建立。数据前瞻性收集、定期核对并输入电子数据库。研究护士负责向患者提供随访提醒（每1-3个月）。分析中使用活检时（索引日）和随访期间的MN患者的临床和病理信息。最终数据收集于2023年12月20日至31日进行，期间对所有入组患者进行现场或电话随访和结局确认。仅纳入具有完整血清样本和至少6个月随访数据的患者。在肾活检当天或前一天，常规采集血样，离心后于-80°C冷冻储存。根据当前的肾脏病：改善全球结局（KDIGO）指南，MN根据24小时尿总蛋白（24h-UTP）排泄量和估计肾小球滤过率（eGFR）分为四个风险组：低风险、中风险、高风险和极高风险。低风险组患者可接受随访观察或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）阻断剂治疗。对于中风险、高风险和极高风险组患者，根据临床医生的判断选择皮质类固醇和/或免疫抑制剂/生物制剂治疗。肾活检队列研究经山西医科大学第二医院伦理委员会批准（编号：2015-KY-006）。研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，所有患者提供书面知情同意。

自2019年1月起，血清抗PLA2R抗体检测已成为所有以蛋白尿为主要表现的患者的标准诊断程序。因此，抗PLA2R抗体数据从医疗记录中回顾性收集。检测方法使用酶联免疫吸附测定（ELISA，Euroimmun）。ELISA结果判读如下：>20 RU/mL为阳性。NELL-1和EXT1/2抗原的检测使用上述活检前冷冻的血样。使用ELISA试剂盒（J&L Biological，中国）按照制造商说明进行操作。NELL-1抗原的ELISA结果判读如下：>1.25 ng/mL为阳性；抗EXT1/2抗原的ELISA结果判读如下：>1 ng/mL为阳性。患者根据血清中生物标志物类型和三种临床诊断（IMN、MLN、UAMN）进行分组。

临床结局是蛋白尿缓解的发生率，包括完全缓解（CR）或部分缓解（PR）、无反应和复发。CR的特征是24h-UTP排泄量降至≤0.3 g/天，同时血清白蛋白水平正常且肾功能稳定。PR定义为24h-UTP比值降低≥50%且最终排泄量≤3.5 g/天。无反应定义为随访期间24h-UTP始终高于3.5 g/天，且尿蛋白减少小于50%。复发定义为在CR或PR后新出现24h-UTP >3.5 g/天。蛋白尿缓解指CR和PR。肾小球滤过率（GFR）使用CKD流行病学协作组（CKD-EPI）肌酐公式计算。平均动脉压（MAP）通过舒张压的三分之二加上收缩压的三分之一来确定。所有病理切片由两位经验丰富的肾病病理学家之一独立重新评估以验证先前的诊断。

所有随访期至少12个月的患者被纳入分析。连续数据报告为均值±标准差，或中位数（四分位距[IQR]），两组间比较使用两独立样本t检验。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），必要时辅以Kruskal-Wallis H检验进行两两比较；否则使用非参数秩和检验。分类数据以数字（百分比）呈现，组间比较使用卡方检验或Fisher精确检验。采用Spearman相关分析评估基线血清NELL-1/EXT1/2滴度与尿蛋白/血清白蛋白水平变化之间的关系。数据分析使用SPSS Statistics（版本26.0，IBM）和GraphPad Prism（版本9.5）进行，所有检验的显著性水平设定为p < 0.05（双尾）。

结果

研究队列

从2019年1月至2022年12月，共有1651例连续患者在山西医科大学第二医院接受肾活检。根据纳入和排除标准筛选后，最终197例患者被纳入研究。在这197例患者中，152例（77.2%）抗PLA2R抗体阳性，17例（8.6%）NELL-1抗原阳性，13例（6.6%）EXT1/2抗原阳性，其余15例患者（7.6%）对所有三种生物标志物（抗PLA2R抗体、NELL-1抗原、EXT1/2抗原）均阴性。所有入组患者根据不同生物标志物类型和病因学诊断分层的基线临床特征已呈现。

197例患者中，122例为男性，中位年龄为49.0岁。基线时中位24h-UTP排泄量为3.6 g/24h，中位eGFR水平为106.2 mL/min/1.73m²。71例（36.0%）患者有高血压，22例（11.2%）有糖尿病，102例（51.8%）无任何伴随疾病。病理检查显示，186例患者诊断为IMN，占整个队列的94.4%。其他包括4例（2.0%）V型MLN和7例（3.6%）UAMN。IMN的分期主要为1至2期，比例为85.3%。共有46例肾病综合征IMN患者接受了抗凝治疗，包括依诺肝素和低分子量肝素（LMWH）。其中41例（89.1%）为血栓预防性治疗，其余5例（10.9%）因已确诊血栓栓塞而接受治疗性抗凝。

治疗

根据MN治疗指南，入组患者分为治疗组和非治疗组。治疗组进一步分为：RAAS阻断疗法和免疫抑制治疗（IST）。IST包括皮质类固醇和/或免疫抑制剂和/或生物制剂。免疫抑制剂包括环磷酰胺（CYC）、钙调神经磷酸酶抑制剂（CNIs）如环孢素A和他克莫司、羟氯喹、雷公藤多苷、霉酚酸酯和来氟米特，使用的生物制剂是利妥昔单抗（RTX）。

肾活检后，188/197（95.4%）患者加入了我们的治疗方案。中位随访时间为13.0（IQR, 12.0–18.0）个月。其中，122/188（61.9%）患者接受了IST，其余66/188（33.5%）患者选择仅接受RAAS阻断剂治疗。聚焦于IST暴露，110例（55.8%）患者暴露于糖皮质激素（GC）。20%的患者（22/110）单独接受口服GC，另外80%接受GC联合其他IST。CNIs、RTX和CYC是最常处方的IST（分别为23.4%、11.7%和22.3%）。肾活检后最初六个月内的治疗也已呈现。在随访期间，31例患者（15.8%）未能通过单独RAAS阻断疗法实现蛋白尿缓解。其中，8例患者（4.1%）对初始6个月RAAS阻断疗法无反应，随后需要转换为IST。

阳性生物标志物与临床结局

在197例入组患者中，152例抗PLA2R抗体阳性，17例NELL-1抗原阳性，13例EXT1/2抗原阳性。我们比较了三组间的基线临床特征和结局，揭示了乙肝病毒（HBV）感染率的显著差异。病理检查进一步显示所有组均存在显著的结节性系膜硬化和小动脉玻璃样变。

在17例NELL-1抗原阳性MN患者队列中，有7名女性和10名男性，中位年龄48岁（范围：23-63）。10例患者（58.8%）IgG1免疫染色阳性，7例（41.2%）IgG4阳性，6例（35.3%）IgG2阳性，5例（29.4%）IgG3阳性。中位随访时间12.0（IQR 12.0–21.0）个月，11/17例患者（64.7%）接受了IST，8例患者（47.1%）达到CR或PR。无患者报告复发。由于患者数量少，我们未研究组间治疗效果的差异。

在13例EXT1/2抗原阳性患者中，11例（84.6%）IgG1阳性，9例（69.2%）IgG4阳性。基线时中位24h-UTP排泄量为3.4 g/24h，中位eGFR为93.8 mL/min/1.73m²。仅4例（30.8%）接受了IST，其余9例患者仅接受RAAS阻断疗法。经过中位21.0（IQR 16.5–25.5）个月的随访，6例（46.2%）患者达到CR或PR，1例患者经历复发。1例EXT1/2抗原阳性女性患者被诊断为MLN，并在IST后15个月未能达到临床缓解。

在本研究纳入的197例患者中，中位随访时间13.0（IQR 12.0 –18.0）个月，133例（67.5%）个体实现蛋白尿临床缓解。具体而言，75例（38.1%）患者达到CR，58例（29.4%）患者达到PR。相反，64例（32.5%）患者未达到临床缓解，包括51例（25.9%）无反应和13例（6.6%）复发。缓解组和非缓解组的基线临床数据已呈现。

我们评估了基线血清NELL-1和EXT1/2滴度与尿蛋白和血清白蛋白水平纵向变化之间的相关性。分析显示基线抗体滴度与蛋白尿或血清白蛋白的变化之间无显著相关性。

在NELL-1抗原和EXT1/2抗原阳性队列中，我们未发现突出和独特的临床及病理特征。

讨论

这项回顾性单中心研究纳入了197例经肾活检确诊的MN患者。我们发现152例（77.2%）患者抗PLA2R抗体阳性，17例（8.6%）NELL-1抗原阳性，13例（6.6%）EXT1/2抗原阳性，其余15例（7.6%）对所有三种生物标志物均阴性。该研究结果与Pierre Ronco的一项研究发现NELL-1与约8%的IMN病例相关，以及Sanjeev Sethi的一项研究表明EXT1/2可能占MN病例的5-10%的结果一致。首先，经过13.0（IQR 12.0 –18.0）个月的随访，197例患者中总共133例（67.5%）达到临床缓解（包括75例（38.1%）CR和58例（29.4%）PR），64例（32.5%）未达到缓解（包括51例（25.9%）无反应和13例（6.6%）缓解后复发）。其次，逻辑回归显示高血压病史和24h-UTP是影响患者是否实现蛋白尿CR的独立风险因素。最后，在NELL-1抗原阳性和EXT1/2抗原阳性患者的特异性分析中，IgG1是肾活检组织中NELL-1抗原阳性和EXT1/2抗原阳性患者的主要IgG亚类。在NELL-1抗原阳性患者中，中位随访12.0（IQR 12.0–21.0）个月，8例（47.1%）达到CR或PR，无患者复发。在EXT1/2抗原阳性患者中，中位随访21.0（IQR 16.5–25.5）个月，6例（46.2%）达到CR或PR，1例（7.7%）复发。

IMN是成人肾病综合征的常见原因，约三分之一患者可能经历自发缓解，而其他患者可能经历长期肾功能恶化。IMN的常规方法最初涉及独立的支持治疗，并在患者的整个治疗过程中维持。这包括控制血压、使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）或血管紧张素受体阻滞剂（ARBs）以减少蛋白尿、增加自发缓解的可能性、限制盐摄入以及使用利尿剂管理水肿。在本研究中，58.4%的患者接受了ACEIs或ARBs治疗，这与该原则一致。随着免疫抑制疗法在IMN患者中的广泛使用，MN患者的预后已显著改善。CYC联合GC长期以来被认为是IMN的金标准治疗，缓解率约为72–93%。在2021年KDIGO指南发布之前，RTX通常被认为可用于对免疫治疗无反应的IMN患者，但基于其直接诱导B细胞凋亡的机制，RTX的应用变得更加广泛，2021年KDIGO指南正式将RTX列为治疗IMN的一线药物。指南建议RTX、CNI±GC或CTX+GC或RTX+CNI可作为中高风险患者的初始治疗。在我们的研究中，中位随访13.0（IQR, 12.0–18.0）个月，188例（95.4%）患者接受了RAAS阻断剂或IST治疗。考虑到疾病严重程度，122例（61.9%）患者接受了IST，66例（33.5%）选择仅接受RAAS阻断剂治疗。在接受IST的患者中，110例（55.8%）暴露于GC。20%的患者单独接受口服GC，另外80%联合其他IST。CNIs、RTX和CYC是最常用的IST（23.4%、11.7%和22.3%）。近年来，RTX在MN中的使用有所增加。我们研究中RTX使用比例相对较低可能归因于其初始应用和高成本。在CNIs减量或停药期间使用RTX对预防对环孢素或他克莫司有反应的IMN患者复发具有有益作用。这些发现表明未来的治疗策略可能需要联合不同药物以提高缓解率并降低复发率。

共有56.3%的患者在肾活检后6个月内启动了IST，这偏离了KDIGO指南建议至少观察等待六个月以监测自发缓解的建议。在分析接受IST患者的基线数据后，原因可考虑如下。首先，许多患者在实验室检测发现这些情况之前很久就表现出肾脏疾病的临床表现，如蛋白尿和低白蛋白血症，疾病过程可能持续超过六个月。因此，临床医生通常认为这些患者不太可能实现自发缓解。其次，许多患者在肾活检前出现血栓栓塞等并发症，表明需要立即进行IST。此外，许多患者显示出高滴度的抗PLA2R抗体，导致临床医生认为此类患者的缓解可能性低。因此，许多患者在不满足KDIGO指南 outlined 适应症的情况下开始接受GC和/或免疫抑制剂治疗。这种偏离基于指南的MN治疗方案在“治愈肾小球疾病网络（CureGN）”队列研究中也很明显，其中55%的成年人在肾活检后六个月内启动了IST，包括那些尿蛋白与肌酐比值低于4 g/g的患者。

随着对MN分子机制更深入的理解，诊断和治疗策略已进入分子时代，越来越依赖分子标记和靶向治疗。治疗的核心目标是减少抗体产生和上皮下免疫复合物沉积。目前，临床实践中可用于MN中B细胞治疗的靶向药物包括抗CD20单克隆抗体（RTX、ofatumumab、obinutuzumab）、浆细胞耗竭剂（daratumumab）和B细胞活化因子抑制剂（belimumab）。新药的激增为缓解MN中的蛋白尿开辟了更多可能性，从而更好地控制患者肾脏疾病的进展。

IST显著改善了患者的蛋白尿缓解。在本研究中，133例患者（67.5%）实现蛋白尿临床缓解。相反，64例（32.5%）患者未达到临床缓解。基于对不同生物标志物分组以及是否使用免疫抑制的患者进行分组，使用免疫抑制的患者缓解数量多于未使用免疫抑制的患者。Wang等人报道一些NELL1阳性患者在IST后实现蛋白尿缓解，但缓解率相对较低。长期随访显示NELL1阳性患者进展至终末期肾病（ESRD）的风险较高，约为20–30%。同时，我们的研究发现高血压病史和24h-UTP是影响患者是否实现完全蛋白尿缓解的独立风险因素。这与一项国外研究一致，该研究纳入132例IMN患者，发现高血压是临床蛋白尿缓解的风险因素。在17例NELL-1抗原阳性患者中，11例（64.7%）在随访期间接受了IST，8例（72.7%）达到CR或PR。在13例EXT1/2抗原阳性患者中，4例（30.8%）接受了免疫抑制剂治疗，其中1例（25.0%）达到CR。由于样本量小，难以确定NELL-1抗原或EXT1/2抗原阳性患者的最佳治疗策略。未来需要更大样本量的研究来进一步调查这一领域。

在我们的研究中，NELL-1抗原阳性患者的性别比例基本相同；该结果与Sethi等人的结果相似。在Sethi的一项研究中，验证队列的五名阳性患者中检测到四名患有癌症。然而，这些肿瘤在我们的队列中未检测到。其他研究也发现NELL-1阳性与较高的蛋白尿水平和疾病活动度相关。在我们的队列中未发现血清NELL-1和EXT1/2对治疗反应有显著的预测价值。这可由四个关键因素解释。首先，不明的机制联系限制了预测性：尽管它们是已确立的足细胞抗原，但其血清水平与免疫调节、足细胞修复或肾脏恢复之间的联系途径仍未明确。因此，它们作为替代标记物的能力被削弱。其次，疾病异质性可能损害其效用：NELL-1相关MN既包括原发性病例，也包括与含硫醇药物、恶性肿瘤或感染相关的继发性形式，而EXT1/2相关MN主要与年轻女性的自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮）相关。我们队列中未诊断的病因学差异（通过常规临床测试）可能导致对标准疗法的亚组治疗反应可变，使得抗原滴度本身不足以反映差异疗效。第三，混杂的临床/病理因素（年龄、基线肾功能、蛋白尿、合并症、肾小球硬化）对我们队列结局的影响比这些抗原更占主导地位。最后，个体间变异性（例如，遗传多态性、免疫抑制剂药代动力学差异）可能导致即使滴度相似反应也不同，凸显了仅依赖这些标记物的局限性。

在原发性MN中，IgG1和IgG4沿GBM高表达，并且PLA2R和血小板反应蛋白1型结构域包含7A（THSD7A）与IgG4沿GBM共定位。在Wang的研究中，孤立性NELL-1阳性MN患者的肾小球IgG1染色阳性率为73%，而IgG4占主导为67%；在我们的研究中，IgG1在NELL-1抗原阳性和EXT1/2抗原阳性患者的所有IgG分型中百分比最高。然而，我们中心相关的NELL-1抗原和EXT1/2抗原阳性患者较少，IgG亚类的表达应在更多病例中进一步观察。

伦理声明

本研究经山西医科大学第二医院伦理委员会批准（批准号：No. 2015-KY-006）。获得了所有患者的书面知情同意。

数据可用性声明

当前研究期间生成和/或分析的数据集由于伦理/法律限制不公开可用。进一步询问可 directed to the corresponding author.