优化α-半乳糖苷酶A酶活性截断值对法布里病筛查的诊断价值与成本效益评估：一项针对慢性肾病患者的单中心研究

本综述系统评估了在慢性肾病（CKD）患者中调整α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）活性截断值对法布里病（Fabry disease）筛查的意义。研究发现，将酶活性截断值从1.2 μmol/L/h提升至2.0 μmol/L/h可显著提高诊断敏感性（AUROC 0.996），额外检出两例患者且具有良好成本效益（增量成本$8,010/例）。研究为优化高危人群筛查策略提供了重要循证依据。

　　

Abstract

法布里病在慢性肾脏病（CKD）患者中的诊断重要性日益凸显。虽然干血斑（DBS）检测α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）活性是常用筛查方法，但该人群中的最佳酶活性截断值仍不明确。本研究回顾性分析了2018年10月1日至2023年9月31日期间在台中荣民总医院开展的法布里病筛查项目数据。男性CKD或终末期肾病（ESKD）患者接受DBS α-Gal A酶活性检测，酶活性＜2.0 μmol/L/h者转诊进行确诊性遗传检测。我们评估了诊断率、真阳性/假阳性和真阴性病例的基线特征，并采用受试者工作特征（ROC）分析确定最佳诊断阈值。在1,654例接受筛查的患者中，35例酶活性＜2.0 μmol/L/h，其中6例（0.36%）经遗传检测确诊为法布里病。将筛查阈值从1.2放宽至2.0 μmol/L/h后，额外检出2例病例。ROC分析确定最佳截断值为1.96 μmol/L/h（AUROC 0.996，95%CI: 0.991–1.000），敏感性达98.3%（95%CI: 0.9769–0.9891），特异性为100%（95%CI: 1-1）。假阳性结果患者的白细胞计数显著低于真阳性病例。额外检出两例法布里病患者的增量成本为8,010美元，在台湾医疗体系下具有可接受的成本效益。将α-Gal A酶活性截断值从1.2扩大至2.0 μmol/L/h提高了CKD患者法布里病筛查的诊断性能，并证明具有成本效益。

Introduction

台湾是全球慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病（ESKD）发病率和患病率最高的地区之一。1999-2009年开展的基于社区的筛查项目报告CKD 3-5期患病率为9.06%，年发病率为16.89/1,000人年。2014年，台湾ESKD治疗发病率和患病率分别高达455例/百万人口（pmp）和3,219.4 pmp，为全球最高记录。尽管到2020年ESKD治疗发病率略有下降（525 pmp），台湾仍是ESKD负担最重的地区之一。

法布里病是一种X连锁遗传性鞘糖脂代谢途径疾病，特征为α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）活性缺乏或缺失。根据系统综述和荟萃分析，透析患者中的总体患病率为0.10%。这种酶缺陷导致鞘糖脂（特别是globotriaosylceramide, Gb3）在全身各类细胞中逐渐积累，引起多系统、异质性的临床表现。Gb3积累启动病理级联反应，导致进行性组织和器官损伤，包括肾脏疾病。早期诊断可实现及时治疗，但许多患者直到30岁后才被诊断，此时常已出现显著器官受累。

因此，多项研究报道了在CKD患者中成功实施法布里病筛查方案。近期发表的专家共识文章回顾了2010-2023年台湾法布里病筛查数据，报告CKD患者患病率为0.6%。然而，本机构通过CKD患者筛查方案确定的法布里病患病率（0.16%）低于先前报道。为此，我们重新分析了机构CKD筛查数据库，以重新评估诊断率，并探索可能提高筛查测试（DBS检测）性能的潜在截断值。我们还旨在分析与假阳性和真阳性结果相关的潜在因素，并评估在法布里病筛查测试中使用较低阈值值的成本效益。

Materials and methods

Definition of population and study design

我们于2018年10月1日至2023年9月31日期间启动了针对男性CKD或ESKD患者的法布里病广义筛查项目。初步筛查采用DBS检测测量α-Gal A酶活性。DBS样本由经认证的参考实验室（Archimed Life Science GmbH）检测，该实验室使用标准内部对照并以β-半乳糖苷酶作为参考酶。通过同步比色控制和提取效率验证样本完整性。

根据先前报道，酶活性水平＜0.6 μmol/L/h视为筛查测试阳性，随后进行确诊性遗传检测。酶活性在0.6-1.2 μmol/L/h之间的病例归类为疑似阳性，也转诊进行遗传确认。一项西班牙人群研究将截断值提高至2.6 μmol/L/h。在我们先前的研究中，我们也使用该阈值（酶活性＜1.2 μmol/L/h）筛查患者进行确诊性遗传检测。该研究在2018年4月至2022年6月期间招募了1,812例男性患者，涵盖ESKD前期、透析和肾移植受者群体。最终经遗传检测确定的真阳性病例仅4例。因此，鉴于先前范围内的低诊断率，我们在本研究中扩大了筛查标准，将酶活性水平在1.2-2.0 μmol/L/h之间的患者纳入遗传检测。通过DBS测定酶活性在1.2-2.0 μmol/L/h之间的患者被召回医院进行遗传检测。我们重新定义了酶筛查测试阳性的阈值，即活性水平低于2.0 μmol/L/h。此外，本研究旨在评估将筛查截断值放宽至2.0 μmol/L/h对法布里病识别的有效性。

我们还比较了真阳性（酶测试和遗传测试阳性）、真阴性（酶测试阴性）和假阳性组（酶测试阳性但遗传测试阴性）的基线特征。我们也比较了假阳性组和真阴性组的基线特征。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析确定预测法布里病最终诊断的最佳酶活性截断值。由于数据经去标识化处理，豁免知情同意。数据在台中荣民总医院收集用于进一步分析，并获得机构审查委员会批准（批准号：CE20177B-3, TCVGH）。

DBS enzyme assay protocol

完整的筛查方案，包括基于DBS的酶测试和随后的遗传测序。此外，详细DBS方案描述见补充方法-DBS酶测定方案。酶活性值低于既定阈值（如＜1.2或＜2.0 μmol/L/h）被解读为提示可能法布里病。筛查方案仅包括男性患者，因为女性携带者的酶活性通常因随机X染色体失活而处于正常范围，这降低了女性的诊断敏感性。

虽然本研究未进行直接定量，但根据既定方案和先前文献，DBS卡单个3.2 mm打孔通常产生约20-50 ng基因组DNA，浓度范围为3-10 ng/μL。该量通常足以进行下游遗传分析，如PCR扩增和Sanger测序。蛋白质方面，每个3.2 mm打孔估计包含约1-2 μg总蛋白，取决于血细胞比容和样本质量。该蛋白质产量足以使用标准荧光或比色法进行α-Gal A酶活性测定。

Other data collection

我们扩展了方法以明确解释：临床和实验室数据由委员会认证的肾病专家从医院电子病历系统中提取，然后由第二位肾病专家交叉验证编码准确性和诊断确认。数据收集的更详细信息见补充方法-其他数据收集。

Statistical analyses

分类变量采用卡方检验比较组间关联。连续变量根据数据分布情况，以均值±标准差（Mean ± SD）或中位数与四分位距（median (IQR1 and IQR3)）呈现描述性统计。采用Shapiro–Wilk检验评估正态性。对于正态分布的连续变量，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）。当违反正态性假设时，应用非参数Kruskal–Wallis检验。进行ROC曲线分析以确定预测法布里病确诊的最佳酶活性截断值。所有统计分析使用SPSS Statistics（版本22.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA）和R软件（版本4.3.1; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）进行。双尾p值＜0.05被认为具有统计学显著性。

Results

Patient selection and screening algorithm

患者选择算法如图2所示。2018年10月1日至2023年9月31日期间，对台中荣民总医院肾病科所有男性患者（n=1716）进行了DBS检测测量α-Gal A酶活性。其中62例患者因无CKD或ESKD或女性性别被排除分析。最初，我们的筛查方案针对我们CKD、血液透析（HD）和腹膜透析（PD）诊所中肾功能不全的患者。所有入组患者预期有潜在慢性肾功能不全。然而，在分析该队列数据时，我们识别出62例患者没有任何与慢性肾功能不全相关的诊断。具体而言，32例仅患有糖尿病 mellitus 无CKD证据，30例患有急性肾损伤并在出院后完全缓解，未进展为慢性肾脏病。因此，我们将这62例患者从最终分析中排除。

其余1654例患者根据肾脏状况分为三组：1039例CKD患者、118例接受PD和497例接受HD。为提高诊断率，我们将酶活性筛查的截断值放宽至2.0 μmol/L/h。α-Gal A酶活性＞2.0 μmol/L/h的患者（n=1619）被视为真阴性，未进行进一步遗传确认检测。相反，酶活性＜2.0 μmol/L/h的患者（n=35）被转诊进行遗传确认检测。经遗传分析，6例患者被识别为真阳性（酶活性阳性和确认的法布里病遗传突变）（基因信息和临床表现见补充表1），而29例患者被归类为假阳性（酶活性阳性但无确认性遗传突变）。如果α-Gal A酶活性截断值设定为1.2 μmol/L/h，识别出的真阳性患者数量减少至4例。通过放宽α-Gal A酶活性截断值，额外2例患者为法布里病真阳性。

Baseline characteristics among three groups (true negative, false positive and true positive)

最终队列包括CKD 3-5期患者以及接受HD或PD的患者。三组的基线特征总结于补充表2。所有患者中，1619例被分类为真阴性，29例为假阳性，6例为真阳性。所有患者均为男性。真阳性组更年轻，中位年龄49岁（IQR: 36–63），假阳性组为68岁（IQR: 60–81），真阴性组为62岁（IQR: 53–70）。痛风在所有三组中常见，假阳性组患病率48.3%，真阳性组50.0%，真阴性组74.4%。类似地，心力衰竭每组中超过一半患者存在：假阳性组58.6%，真阳性组50.0%，真阴性组57.1%。值得注意的是，真阳性组中无患者有肝硬化。实验室发现方面，真阴性组平均WBC计数（7,178 ± 2,542/μL）高于假阳性（4,322 ± 1,607/μL）和真阳性组（6,365 ± 2,211/μL）。估计肾小球滤过率（eGFR）在真阴性组也最高（37.91 ± 27.59 mL/min/1.73 m²），假阳性组（26.07 ± 23.34 mL/min/1.73 m²）和真阳性组（26.29 ± 32.77 mL/min/1.73 m²）较低。电解质水平在所有三组中相似。关于药物使用，真阳性组抗血小板药物（16.7%）和胰岛素（16.7%）使用率最低。

Baseline characteristics between false positive and true positive

随后，我们分析了基线特征以识别与假阳性和真阳性结果相关的因素（表1）。尽管无统计学显著性，假阳性组呈现α-Gal A酶活性更高趋势（1.67 ± 0.29）与真阳性组（1.13 ± 0.60）相比（详细酶活性见补充图1和补充图2）。与真阳性患者相比，假阳性结果患者年龄显著更大（69 ± 14岁 vs. 49 ± 20岁, p=0.005）并表现出更高白细胞减少症患病率（4322 ± 1607 cells/μL vs. 6365 ± 2211 cells/μL, p=0.015）。两组在合并症、恶性肿瘤、血红蛋白水平、血小板计数、肝肾功能、代谢标志物、电解质、左心室射血分数、高敏CRP或药物使用方面无显著差异。

ROC curve analysis and determination of enzyme activity cutoff for predicting fabry disease confirmation

ROC曲线呈现于图3。识别出预测法布里病确认的最佳α-Gal A酶活性截断值为＞1.96 μmol/L/h，具有近乎完美的诊断准确性。ROC曲线下面积（AUROC）为0.996（95%CI: 0.991–1.000），表明极好的判别能力。在此截断值下，敏感性为98.3%（95%CI: 0.9769–0.9891），特异性为100%（95%CI: 1-1）。

Cost-effectiveness due to the broadened cutoff value of the enzyme activity screening test from 1.2 to 2.0 μmol/L/hr

酶活性测量的每次成本为27美元，而遗传确认测试的成本为267美元。我们将酶活性的截断值从1.2 μmol/L/h放宽至2.0 μmol/L/h以确定进一步遗传确认测试的资格。结果，30例酶活性水平在1.2和2.0 μmol/L/h之间的患者接受了遗传测试。该方法识别出2例额外真阳性病例，其余28例患者为假阳性。这30例患者遗传测试的总额外成本为8,010美元，产生两例额外真阳性诊断。每次诊断的成本在本研究背景下被认为可接受。

Discussion

基于我们的发现，CKD患者中α-Gal A酶活性的筛查阈值可从1.2调整至2.0 μmol/L/h，证明在保持可接受成本效益的同时改善了预测性能。我们建议，当筛查CKD患者时，α-Gal A酶活性低于2.0 μmol/L/h者应接受确诊性遗传测试。

我们的数据发现，假阳性病例（特征为酶活性较低但无法布里病确认）与真阳性病例相比白细胞计数显著更低（4322 ± 1607/mm³ vs. 6365 ± 2211/mm³, p=0.015）。α-Gal A的酶活性主要在白细胞中测量，突出了白细胞计数对影响酶活性的重要性。DBS样本由全血制备——包含红细胞、白细胞、血浆和其他成分——将其印迹在滤纸上然后干燥。在α-Gal A活性测试期间，处理样本以提取酶。这些酶主要来源于WBC和其他含有溶酶体的细胞。然而，红细胞对测量的酶活性贡献极小，因为它们缺乏溶酶体。DBS反映了复合的细胞内酶活性，尤其是WBC。尽管未进行专用的白细胞测定，但DBS酶活性主要反映白细胞来源的活性。因此，白细胞计数较低的患者可能表现出降低的α-Gal A酶活性，潜在地导致DBS筛查测试中的假阳性结果。该观察得到一项涉及263例患者的研究发现的支持，该研究报告低白细胞计数的干血样本中的酶活性通常低于既定参考区间，可能导致假阳性诊断。先前研究的作者建议，基于白细胞计数调整酶活性测量可能提高诊断准确性并降低假阳性率。然而，鉴于我们数据集中病例数量有限，我们无法就基于白细胞计数的阈值调整得出明确结论。在我们的分析中，此类调整可能非必要，因为观察到的假阳性率较低（1.75%）。此外，在台湾医疗体系框架内，实施修订截断值的成本效益被认为可接受，以8,010美元的增量成本产生两例额外真阳性患者。此外，这两例患者能够及时接受酶替代疗法，潜在地预防严重并发症的发展并导致额外的长期成本节约。因为台湾全民健康保险提供近乎全民覆盖和标准化CKD护理，法布里病筛查的成本与其他国家相比相对较低。因此，台湾观察到的成本效益在外推至其他医疗体系时可能不那么有利。

对于那些假阳性者，我们告知患者需要进一步确诊性遗传测试。确认前未进行治疗；因此，无临床影响。关于心理效应，不必要的焦虑最小，因为患者被告知最终诊断取决于遗传测试。因此，在新阈值下，成本效益益处未与额外 adverse 影响相关。

DBS测量的酶活性主要反映来自白细胞和其他有核细胞的细胞内α-Gal A。然而，基于DBS的酶测定通常不调整白细胞计数，因为DBS标本无法获得确切的WBC计数。一些研究和确诊性诊断方案采用分离的白细胞样本或同时评估WBC计数以计算调整后的酶活性，通常表达为：调整后酶活性 = 测量酶活性/WBC计数。该方法通过考虑个体白细胞浓度变异性增强诊断准确性。在我们机构，为了最大化病例识别和通量，我们选择不按WBC计数调整酶活性。相反，潜在阳性病例直接转诊进行GLA基因测序以确认诊断。

酶活性以μmol/L/h表示。尽管各种研究提出了定义低α-Gal A酶活性的不同截断值，文献中报告的阈值范围从0.6到2.5 μmol/L/h。最初，＜1.2 μmol/L/h的阈值基于Archimed Life Science GmbH实验室进行的ROC曲线分析定义。然而，CKD患者的酶活性也在几项先前研究中检查过。在一项土耳其CKD队列中，使用1.2 μmol/L/h的截断值启动确诊性遗传分析，报告患病率为0.95%。在另一项哥伦比亚ESKD患者筛查研究中，α-Gal A活性的截断值设定为1.15 μmol/L/hr。此严格阈值可能反映由于财务限制的局限性，潜在地导致漏诊。在一项法国研究中，2.1 μmol/h/L的截断值显示稳健且有效减少假阳性结果，使其适用于筛查高危人群。在一项巴西血液透析患者队列中，最初使用2.5 μmol/L/hr的截断值；然而，由于高假阳性率，该阈值随后基于ROC曲线分析调整至2.2 μmol/L/hr，同时保持100%敏感性。该截断值随后在巴西男性血液透析患者中广泛采用，突出了家族筛查的重要性。此外，一项研究中采用了低阳性血浆α-Gal A活性截断值，定义为4 μmol/L/hr。至今，无已发表研究评估采用较宽松α-Gal A活性截断值的成本效益。我们提议，在我们临床背景下，2.0 μmol/L/hr的截断值提供最佳平衡——增强法布里病诊断率同时保持可接受的筛查成本和假阳性率。

超越经典法布里病，意义不确定的变异（VUS）和良性多态性相对于酶活性阈值的影响需要仔细考虑。首先，适当定义的α-Gal A活性阈值不仅对识别受影响个体有价值，而且对排除良性多态性有价值。通过最小化错误分类非致病性变异的风险，此类阈值增强筛查的特异性并确保仅酶活性临床意义降低的个体被转诊进行确诊性遗传测试。其次，新型VUS的出现呈现持续诊断挑战。在某些情况下，尽管存在VUS，α-Gal A活性可能超过2 μmol/L/hr，潜在地导致错误分类。这突出了酶活性作为独立筛查工具的局限性，并强调了遗传确认以区分致病性突变与VUS的必要性。

本研究有几个局限性。首先，样本量仍然有限，可能影响发现的普遍性。有限病例数可能降低组间统计比较的稳健性。我们承认此局限性，它也可能影响ROC衍生截断值的稳定性。其次，结果仅适用于男性患者，因为由于X连锁遗传模式，女性中的诊断方法不同。因为法布里病在男性中往往表现更严重，我们在我们机构优先筛查男性患者。然而，我们也有女性筛查方案。对于呈现至少两个临床特征——如左心室肥厚（＞13 mm）、心律失常、不明原因CKD或早发性卒中——的女性患者，我们启动筛查。第一步是DBS测试测量lyso-Gb3水平。lyso-Gb3值高于0.8 ng/mL视为异常。如果升高，我们进行α-Gal A酶活性测试（＜1.5 μmol/L/hr）并通过遗传分析确认诊断。第三，研究人群限于已确诊CKD或接受透析的个体，限制了其应用于疾病更早阶段或一般人群。未来，我们计划纳入机器学习技术以开发针对此复杂、多系统 disorder 的新颖诊断工具。此外，我们旨在应用大语言模型在进行酶活性和遗传测试前预筛查我们机构内所有患者，这可能进一步提高效率和成本效益。第四，此阈值适用于非白细胞调整测定；未来研究应评估白细胞调整阈值。第五，成本效益分析未考虑额外指标，包括QALY和长期治疗成本。最后，鉴于真阳性病例数量有限（n=6），诊断性能的估计应谨慎解释，因为它们可能容易高估。

Conclusion

基于我们的研究，我们提议在CKD患者中将α-Gal A酶活性截断值从1.2提高至2.0 μmol/L/hr。此修订阈值在台湾医疗体系背景下证明有利的预测性能和可接受的成本效益。假阳性可能与白细胞减少症相关。

Author contributions statement

CRediT: Shang-Feng Tsai: 概念化, 数据管理, 形式分析, 资金获取, 调查, 方法论, 项目管理, 资源, 软件, 验证, 撰写初稿, 撰写审阅编辑; Ming-Ju Wu: 数据管理, 调查, 方法论; Hsien-Hsu Hsieh: 数据管理, 方法论, 项目管理; Cheng-Hsu Chen: 概念化, 数据管理, 形式分析, 资金获取, 调查, 方法论, 资源, 软件。