菠萝蛋白酶酶解米糠蛋白肽的超滤组分抗氧化及抗衰老酶抑制活性研究

本研究首次系统评价菠萝蛋白酶酶解米糠蛋白肽（eb-RBPH）及其超滤组分的生物活性。研究发现1–3 kDa肽段（F4）具有最强的DPPH/ABTS自由基清除能力（IC50分别为696.02和444.13 μg/mL）和弹性蛋白酶/胶原蛋白酶/明胶蛋白酶抑制活性（IC50为51.90/17.84/27.72 μg/mL），且对Vero、L929、HaCaT细胞无毒性。该研究为开发抗皮肤衰老功能性食品提供了理论依据。

　　

引言

随着消费者对安全、天然、可持续的合成替代品需求增加，膳食补充剂行业致力于开发新型天然抗氧化剂和酶抑制剂。皮肤老化主要涉及内源性老化和光老化，其中酪氨酸酶（Tyrosinase）、弹性蛋白酶（Elastase）、基质金属蛋白酶（MMPs）和活性氧（ROS）起关键作用。抑制MMPs（明胶酶Gelatinase和胶原酶Collagenase）、弹性蛋白酶和酪氨酸酶活性被认为是预防皮肤过早老化的有效策略。

材料与方法

实验采用泰国茉莉香米105品种的脱脂米糠为原料，通过碱性提取和等电点沉淀分离米糠蛋白（IRBP）。使用菠萝蛋白酶（E.C. 3.4.22.32）在pH 6.0、50°C条件下酶解6小时，获得最高水解度（64.28%）的酶解产物（eb-RBPH）。通过超滤膜分离得到5个分子量段：>10 kDa（F1）、5–10 kDa（F2）、3–5 kDa（F3）、1–3 kDa（F4）和<1 kDa（F5）。采用凯氏定氮法测定蛋白含量，HPLC分析氨基酸组成，Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）。抗氧化活性通过DPPH/ABTS自由基清除能力和铜螯合能力评价。酶抑制活性包括酪氨酸酶、弹性蛋白酶、胶原蛋白酶（MMP-1）和明胶蛋白酶（MMP-2）抑制实验。细胞毒性通过MTT法在Vero、L929和HaCaT细胞系上进行评估。

结果与讨论

氨基酸组成与总酚含量

eb-RBPH蛋白含量为635.60 mg/g，其中F4组分蛋白含量最高（663.00 mg/g）。F4和F5富含丙氨酸、亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸和脯氨酸等抗氧化氨基酸。<1 kDa组分（F5）的总酚含量最高（6.41 μg GAE/mg蛋白），表明低分子量肽与酚类物质存在相互作用。

抗氧化活性

F4（1–3 kDa）表现出最强的DPPH和ABTS自由基清除能力（IC₅₀分别为696.02和444.13 μg蛋白/mL），以及最高的铜离子螯合能力（61.16%）。抗氧化活性与分子量大小相关，<3 kDa的肽段（约10–20个氨基酸）显示出比大分子肽更强的活性。疏水性氨基酸和芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）通过质子捐赠机制增强抗氧化能力，而酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）通过提供电子与自由基相互作用。

酶抑制活性

F5（<1 kDa）对酪氨酸酶的抑制活性最强（IC₅₀=58.22 μg蛋白/mL），可能因其更容易进入酶活性中心。F4（1–3 kDa）对弹性蛋白酶、胶原蛋白酶和明胶蛋白酶的抑制效果最佳（IC₅₀分别为51.90、17.84和27.72 μg蛋白/mL）。酶抑制活性取决于肽的分子量和酶类型，疏水性氨基酸有助于与酶活性位点结合。

细胞毒性

eb-RBPH、F4和F5在10 mg/mL浓度下对Vero、L929和HaCaT细胞的毒性均低于30%，符合ISO 10993-5安全标准，表明其适用于食品和膳食补充剂。

化学计量学分析

皮尔逊相关性分析显示，酪氨酸酶抑制活性与铜螯合能力呈强负相关（r=-0.97），表明铜螯合物质可通过阻断酪氨酸酶活性中心发挥作用。胶原蛋白酶与明胶蛋白酶抑制活性高度正相关（r=0.98），反映其结构相似性。总酚含量与铜螯合能力及DPPH自由基清除能力显著相关，但与ABTS、弹性蛋白酶抑制活性相关性较弱。蛋白含量与弹性蛋白酶抑制活性呈强负相关（r=-0.96），表明蛋白质（肽）对酶抑制的贡献大于抗氧化作用。疏水性氨基酸含量与铜螯合能力、DPPH自由基清除能力和酪氨酸酶抑制活性显著相关。

结论

本研究首次证明菠萝蛋白酶酶解米糠蛋白肽能有效清除自由基并抑制与皮肤老化相关的关键酶（弹性蛋白酶、酪氨酸酶、明胶蛋白酶和胶原蛋白酶）。1–3 kDa肽段（F4）具有最强的综合生物活性和安全性，是开发抗皮肤衰老功能性食品和膳食补充剂的理想候选。后续研究应聚焦于肽序列与生物活性的构效关系，以及包埋策略以提高消化稳定性和储存稳定性。