揭示半索动物与脊椎动物之间隐藏的线粒体同源性：基因排列与密码子使用偏好的新证据

《Heliyon》：Unveiling the hidden connection: Hemichordates and vertebrates share surprising mitochondrial similarities

本研究针对半索动物在后口动物进化中的关键位置及其与脊索动物关系的争议，通过对四种半索动物进行线粒体基因组测序，并结合系统发育、线粒体基因重排和密码子使用偏好性分析，揭示了半索动物与脊椎动物在线粒体基因排列和密码子使用模式上存在显著相似性，表明二者存在深层的线粒体同源性，为理解后口动物早期进化历史提供了新的分子证据。

　　

在生命演化的宏伟画卷中，后口动物（Deuterostomes）的起源与分化一直是科学家们孜孜以求的谜题。这个超级门类包括了人类所在的脊索动物门（Chordata，如脊椎动物、头索动物、尾索动物），以及棘皮动物门（Echinodermata，如海星、海胆）和形态奇特的半索动物门（Hemichordata，如柱头虫）。半索动物，尤其是占其大多数的肠鳃类（acorn worms），因其同时具有一些与脊索动物（如鳃裂、背神经索）和棘皮动物（如幼虫形态）相似的特征，而被视为连接这两大类群的关键演化环节。然而，关于半索动物究竟与棘皮动物更近（构成步带动物Ambulacraria假说），还是与脊索动物更近，基于形态学和分子数据的证据时常相互矛盾，这使得揭示早期后口动物的演化历史充满挑战。

线粒体基因组作为细胞内的“动力工厂”蓝图，因其具有母系遗传、进化速率相对较快、结构相对紧凑等特点，已成为研究动物进化关系的强大工具。除了DNA序列本身的变异，线粒体基因的排列顺序和密码子使用偏好（Codon Usage Bias, CUB）也蕴含着重要的演化信息。基因重排和密码子使用偏好被认为是罕见的基因组变化事件，其趋同发生的概率极低，因此能为推断深部分支关系提供独特的视角。尽管半索动物地位关键，但截至研究开展时，公共数据库中高质量的半索动物线粒体基因组数据十分匮乏，严重限制了我们对其分子演化的理解。

为了填补这一空白，并从一个新的角度审视半索动物与脊索动物的关系，由郭伟健、丁中文等研究人员组成的研究团队在《Heliyon》上发表了他们的最新研究成果。研究人员首先对四种代表性的半索动物（多鳃吻柱头虫Glossobalanus polybranchioporus、青岛鳃腺虫Glandiceps qingdaoensis、三崎玉钩虫Balanoglossus misakiensis 和魏氏柱头虫Glossobalanus weii）进行了完整的线粒体基因组测序、组装和注释。随后，他们整合公共数据库中的大量后口动物线粒体基因组数据，开展了一项多角度的综合分析，包括基于13个蛋白质编码基因（Protein-Coding Genes, PCGs）的系统发育重建、线粒体基因排列模式的比较与祖先状态重建，以及密码子使用偏好性的评估。

为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法。他们从中国青岛胶州湾和海南儋州市的潮间带或潮下带采集了半索动物标本，并采用CTAB法结合QIAGEN基因组试剂盒从动物躯干中提取高质量DNA。利用DNBseqT7平台进行高通量测序后，使用MitoZ v3.6软件流程组装完整的线粒体基因组，并辅以MITOS在线服务器和人工校对进行精确注释。系统发育分析基于13个PCGs的核苷酸和氨基酸序列，使用IQ-TREE进行最大似然法（Maximum Likelihood, ML）分析和使用PhyloBayes进行贝叶斯推断（Bayesian Inference, BI）分析，并考虑了不同的分区策略和位点异质性模型。基因排列分析使用了TreeREx软件进行祖先状态推断和MLGO网络工具进行基于基因排列数据的系统树推断。密码子使用偏好性分析则通过CodonW软件计算相对同义密码子使用度（Relative Synonymous Codon Usage, RSCU）和有效密码子数（Effective Number of Codons, ENc）等指标，并利用R语言进行中性绘图和ENC绘图分析。

3.1. 半索动物线粒体基因组的一般特征

研究人员成功获得了四种半索动物的完整线粒体基因组。它们的长度在15,654 bp（三崎玉钩虫）到16,014 bp（青岛鳃腺虫）之间，均包含标准的37个基因（13个PCGs，22个tRNA基因，2个rRNA基因）。全基因组AT含量在52.4%（魏氏柱头虫）至55.8%（多鳃吻柱头虫）之间，未表现出明显的AT偏向性。所有四种半索动物都表现出正的AT偏斜（AT skew）和负的GC偏斜（GC skew）。分析发现了两种基因排列模式：其中三种半索动物（多鳃吻柱头虫、三崎玉钩虫和魏氏柱头虫）的模式与已知的肠鳃类祖先基因排列一致，而青岛鳃腺虫的排列模式则与其他半索动物显著不同。祖先状态重建表明，半索动物的祖先基因排列与当前大多数物种的常见配置相符，而青岛鳃腺虫的独特排列源于其祖先排列经历了两次转座（transposition）和一次串联重复随机丢失（Tandem Duplication Random Loss, TDRL）事件。

3.2. 系统发育重建

基于13个PCGs的核苷酸和氨基酸序列，研究人员构建了多种系统发育树。尽管不同分析流程（如PCGs_aa_BI, PCGs_aa_ML, PCGs_nt_gene_ML等）在细节上存在一些差异（例如尾索动物的位置不稳定，个别分析中甚至出现长枝吸引现象），但一个常见的、支持度较高的拓扑结构显示，半索动物与棘皮动物构成姐妹群，共同形成步带动物（Ambulacraria）支系，而脊索动物门本身并非单系群，头索动物和脊椎动物的关系在不同树中不一致。值得注意的是，基于密码子分区的最大似然法分析（PCGs_nt_codon_ML）得出了与其他分析不一致的结果，将尾索动物和海蛇尾错误地聚在一起，但这支支持率较低。总体而言，基于氨基酸序列的贝叶斯推断（PCGs_aa_BI）产生的拓扑结构在多个深部分支上获得了最高的支持值。

3.3. 基因排列模式

与基于序列的系统发育分析不同，基于完整基因排列数据（包括重复基因）使用MLGO方法构建的系统树，显示出了一个引人注目的结果：半索动物与一个由头索动物和脊椎动物组成的支系构成姐妹群，且该支系整体上获得强力支持。基于主要基因（PCGs和rRNAs）相对排列顺序的祖先状态重建表明，脊椎动物、半索动物和头索动物的基因排列与后口动物共同祖先（A1）的排列非常相似。随后，nad6基因的一次倒位（inversion）事件导致了头索动物和脊椎动物常见排列模式（A2或A3）的出现。现代半索动物的基因排列则源于位于A3位置的祖先通过一次转座事件形成。此外，后口动物祖先的基因排列通过三次TDRL事件，塑造了现代尾索动物最常见的基因排列。而棘皮动物各纲的基因排列则是从其共同祖先开始，经历了一系列随时间发生的倒位事件演化而来。

3.4. 密码子使用模式

对相对同义密码子使用度（RSCU）的分析显示，半索动物和脊椎动物表现出高度相似的RSCU模式，尽管它们属于不同的演化支系。基于RSCU的UPGMA聚类树将半索动物和脊椎动物聚在一起，而头索动物、尾索动物和海百合则聚在另一支。有趣的是，海胆和海参具有相似的密码子使用偏好，这与物种树、分子树和MLGO树的拓扑结构一致。中性绘图分析表明，在半索动物和脊椎动物的PCGs中，密码子第一、二位点（GC12）与第三位点（GC3）的GC含量呈正相关。ENC绘图分析显示，半索动物和脊椎动物中大多数基因的ENc值位于标准曲线下方，表明自然选择在塑造其线粒体基因密码子使用偏好中起主要作用，突变压力的影响较弱。这进一步支持了半索动物与脊椎动物在密码子使用水平上的深层相似性。

4. 讨论

本研究通过整合线粒体基因组序列、基因排列和密码子使用偏好等多维度证据，深入探讨了半索动物在后口动物中的演化地位。最显著的发现是，半索动物与脊椎动物在线粒体基因排列和密码子使用模式上存在惊人的相似性，这提示了二者之间存在深层的线粒体同源性（deep mitochondrial homology）。

这种基因排列的保守性可能源于系统发育惯性（phylogenetic inertia），即由于线粒体基因在代谢和适应环境中的基础性作用，祖先特征得以长期保留。也可能与线粒体基因间复杂的选择、突变、重排和功能依赖性相互作用有关。半索动物、脊椎动物和头索动物在线粒体排列上的相似性，或许反映了它们代谢模式的共通之处。在密码子使用方面，相似的模式则强烈暗示了共同的自然选择压力在起作用，旨在优化蛋白质表达的效率和准确性。这些基于线粒体分子特征的发现，与一些形态学证据和特定分子实验的结果相呼应，共同指向半索动物与脊椎动物可能拥有一个共享的祖先。

然而，研究也揭示了基于线粒体蛋白质编码基因序列的系统发育分析存在局限性，例如长枝吸引可能导致不可靠的拓扑结构，尾索动物的系统位置不稳定，以及部分半索动物属（如Balanoglossus和Glossobalanus）在某些分析中未能形成单系群等。这凸显了在解决深部分支演化问题时，结合多种不同类型证据（如基因组结构、密码子使用等）的重要性。基于基因排列数据（MLGO树）或RSCU数据（UPGMA聚类树）得到的拓扑结构，与基于序列数据的系统发育树以及以往的核基因研究存在明显分歧，这可能受到趋同进化、水平基因转移或不同谱系进化速率差异等因素的影响。

尽管存在这些复杂性，本研究首次报道的半索动物线粒体基因组新数据，以及从基因排列和密码子使用角度揭示的半索动物与脊椎动物的密切联系，无疑为我们理解后口动物早期演化提供了全新的、有价值的视角。它挑战了传统的基于单一数据源的演化观点，强调了线粒体基因组学在揭示复杂演化历史中的强大潜力。未来的研究需要整合更多的基因组学数据，并扩大分类单元取样，以进一步检验和细化这些发现，从而更清晰地描绘出后口动物演化的壮丽图景。