利用适应性实验室进化策略驱动本土苹果酒酵母基因组适应高压力酿造环境：荞麦与麦芽汁发酵的遗传机制与表型创新

本研究通过适应性实验室进化（ALE）技术，成功将一株分离自斯洛文尼亚传统苹果酒的自发发酵酵母（Saccharomyces cerevisiae）驯化为能高效利用荞麦（富含多酚）和大麦麦芽汁（富含麦芽三糖）的啤酒酵母。在模拟工业高压（1.16 bar）与高CO2压力的连续30代发酵中，进化克隆表现出近完全杂合性缺失（LOH）、新发单核苷酸突变、染色体数目异常（包括三体/四体）及线粒体DNA（mtDNA）结构变异。表型上呈现呼吸缺陷（“petite”表型）、孢子形成能力丧失、非酿造环境下适应性下降以及挥发性风味化合物谱系改变。该研究为拓宽酿造酵母功能多样性及推动精酿啤酒创新提供了可行的进化生物学策略。

　　

引言

近年来，精酿啤酒市场的快速扩张推动了对具有独特风味和营养特性啤酒的需求，这对工业酵母的性能提出了更高要求。然而，啤酒酵母菌株的遗传多样性仍较为有限。传统自发发酵环境是新菌株的重要来源，但这些菌株通常缺乏高效利用富含多酚的荞麦麦汁或富含麦芽三糖的大麦麦汁的能力。为此，本研究采用适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）方法，对一株源自斯洛文尼亚手工苹果酒的自生酵母菌株进行定向驯化，以提升其在高压酿造条件下对荞麦和大麦麦芽汁的发酵效率。

酵母分离与种群结构分析

研究团队从斯洛文尼亚亚高山地区的多个偏远农庄采集了手工苹果酒样本，从中分离出37株_{Saccharomyces}类酵母。通过微卫星PCR指纹图谱技术（SuARS409、SuYBR049C等引物）进行去冗余分析，最终获得12株遗传背景 distinct 的酵母菌株。全基因组测序和覆盖度分析表明，这些菌株包括以_{Saccharomyces uvarum}为主体且带有_{S. eubayanus}基因渗入的冷耐受物种、_{S. cerevisiae}与_{S. kudriavzevii}的杂交菌株，以及少量“纯”_{S. cerevisiae}。特别值得注意的是，其中一个农场C中以_{Saccharomyces paradoxus}为主，且含有来自_{S. cerevisiae}的短片段渗入，这在家养发酵环境中较为罕见。

表型筛选与祖先菌株选择

通过与拉格啤酒酵母TUM 34/70和艾尔酵母SafAle US-05进行对比，研究人员评估了这12株菌株在限制呼吸条件下的生长速率（YPD及以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖为唯一碳源的YNB培养基）以及它们在荞麦和大麦麦芽汁中的发酵性能（糖消耗与乙醇产出）。结果显示，_{S. cerevisiae}及其杂交菌株在麦芽糖上的生长较慢，酒精产量也较低。只有_{S. paradoxus}能够以麦芽三糖为碳源生长，但速率缓慢。所有_{S. uvarum}菌株在酿造条件下的发酵表现均较差。基于其较好的发酵基础及进化潜力，_{S. cerevisiae} ZIM 3704被选为进一步适应性进化的出发菌株。

祖先菌株的基因组特征

通过长读长（PacBio）与短读长（Illumina）测序技术，研究团队完成了ZIM 3704的染色体级别基因组组装（16条核染色体、1条线粒体染色体和1个2μ质粒）。流式细胞术和nQuire软件分析均支持该菌株为二倍体，杂合度为0.8 SNP/kbp，且部分染色体（如II、IX、XI、XII、XIV）存在大片段杂合性缺失（LOH）区域，这些特征与欧洲/葡萄酒种群_{S. cerevisiae}的遗传背景一致。

适应性进化实验设计

进化实验在模拟工业条件的高压发酵罐中进行，系统维持1.16 bar压力、70% N₂ + 30% CO₂气氛，温度14°C。每7天进行一次传代，共30批次。每批发酵结束后，通过离心收集酵母 biomass，并重新接种到新鲜麦汁中。在荞麦麦汁进化线中，酵母约经历120代；在大麦麦汁中则约为150代。每批均监测麦芽糖与麦芽三糖转化率、乙醇和甘油产量、以及细胞活性（亚甲基蓝染色法）。

进化过程中的表型变化

在荞麦麦汁中，前12批发酵中麦芽糖转化率稳定在80%左右。第13批时细胞活性显著下降，导致麦芽糖转化率降至64±5.6%，甘油产量升高，可能与线粒体功能异常导致的NADH再氧化有关。从第21批起转化效率出现波动，直至第27–30批时才达到近乎100%的麦芽糖转化，显示高适应性变异株逐渐取得优势。而在大麦麦汁中，麦芽糖在第8批时即被完全消耗，但麦芽三糖的利用效率提升较慢，最终在第30批达到73±1.7%，较初始提高了2.5倍。

进化克隆的基因组变异分析

从两条进化线中各选取3个形态 distinct 的单克隆进行基因组重测序，并与祖先菌株进行比对。

LOH与新发突变

所有进化克隆均呈现近乎完全的染色体级别LOH，杂合位点比例从祖先的37%上升至99.2%，仅chr. XVI部分区域保留杂合性。估计LOH发生率介于5.7×10^?2–7.4×10^?2 per SNP per division，远高于典型有丝分裂重组频率（10^?4–10^?5），暗示多倍化后的染色体丢失可能是LOH的主要机制。此外，每个克隆平均出现40±8个新发杂合突变，其中4.2±2.6个位于编码区，多为错义突变，尤以荞麦麦汁适应克隆（A6、A9）中积累较多（7–8个）。

非整倍性变化

进化克隆中广泛检出染色体数目异常，包括小型染色体（I、III、V、VI、IX）的三体或四体，在荞麦适应克隆中尤其显著（5–6起事件）。此外，在chr. XVI（所有克隆）和chr. VII（仅大麦适应克隆J7）上还发现大片段的串联重复，其断裂点附近存在头对头排列的Ty2转座子，可能通过同源重组介导了这些结构变异。其中，chr. XVI上一段14 kb的缺失导致10个基因完全丢失，包括硫外排泵基因_SSU1的启动子区域，进而造成进化菌株对亚硫酸盐的敏感性上升。

线粒体基因组的结构与功能变异

荞麦适应克隆中，A1完全丢失线粒体DNA（ρ⁰），A6与A9仅保留_ATP6基因，基因组大小从82 kb缩减至5 kb，造成呼吸缺陷（“petite”表型），无法利用甘油或乙醇生长。大麦适应克隆中，J1与J9缺失细胞色素b基因（_COB），呼吸能力受损；J7则发生rRNA基因重复与重排，但仍保有呼吸能力。这些变异与工业酿造中频繁出现的呼吸缺陷突变表型相符，且底物成分（如荞麦中矿物质和多酚含量）可能是诱导线粒体不稳定的重要因素。

进化克隆的表型验证

适应性成本与孢子形成能力

进化克隆在非酿造条件下表现出适应性降低。与大麦适应克隆（J系列）相比，荞麦适应克隆（A系列）在荞麦麦汁中的相对适应度较高（71±2%），但在大麦麦汁中较低（56±3%）。此外，所有进化克隆孢子形成效率显著下降：祖先菌株产孢效率为55%，而荞麦适应克隆因呼吸缺陷完全丧失产孢能力，大麦适应克隆产孢效率也仅为0.2%–8%，这与其染色体非整倍性和_IME1基因无关。

挥发性风味化合物谱系变化

通过顶空-气相色谱/质谱（HS-GC/MS）分析进化过程中啤酒风味物质的变化，主成分分析（PCA）显示，第14批与第30批发酵产物的芳香成分与初始批次显著分离。至第30批时，1-己醇、乙酸、己酸、辛酸及乙酸异戊酯等物质产量提高了3–20倍，同时新增2-庚酮和十三酸乙酯的检出。表明进化后的菌株不仅糖利用效率提升，还带来了更复杂、果香与酸香更突出的风味谱。

结论与意义

本研究通过ALE在模拟工业压力的环境下成功驯化了一株苹果酒来源的_{S. cerevisiae}，使其能高效发酵荞麦与大麦麦芽汁。进化克隆在基因组层面呈现出LOH、非整倍体、线粒体结构变异等经典驯化特征，表型上则伴随呼吸缺陷、孢子形成能力丧失及风味谱系改变。该策略有效扩展了酿造酵母的功能多样性，为应对市场需求和创新啤酒风格提供了新的菌株开发途径。