小麦驯化中心驱动Clavibacter病原体多样性研究

本研究系统揭示了小麦、大麦和燕麦的驯化中心（伊朗高原）作为Clavibacter病原体多样性热点的重要性。通过田间调查、病理学测定和分子系统发育分析，发现该地区存在至少五个分类学上截然不同的Clavibacter谱系（包括C. tessellarius、C. zhangzhiyongii及三个新谱系），其毒力相关基因组内容相似且均能诱发寄主花叶症状。研究首次报道了多分类群Clavibacter在禾谷类作物上的同时发生，为作物-病原体共进化理论提供了关键证据，对植物病害管理和检疫策略具有重要指导意义。

　　

引言

人类农业约11,000年前起源于扎格罗斯山脉 foothills，该地区被称为肥沃新月地带，是小麦、大麦和燕麦等禾谷类作物的最早驯化中心。考古植物学研究表明，单粒小麦（Triticum monococcum）是最早被驯化的小麦物种，而二粒小麦（Triticum turgidum）的驯化发生在幼发拉底河以西地区。大麦（Hordeum vulgare）和燕麦（Avena sterilis）的驯化同样追溯至该区域。作物驯化与伴生微生物病原体的出现和演化密切相关，对于多数栽培植物而言，作物的驯化中心即被视为相应病原体的多样性中心。然而，部分植物病原体首先在其寄主植物起源地以外的地理区域被发现，这对共进化理论提出了挑战。

材料与方法

调查、采样与细菌分离

2020-2022年期间，在伊朗的禾谷类作物主产区进行了全面调查和采样，覆盖了15个省，包括中部、南部、西北部、北部、西部、西南部、东北部和东南部地区。采样重点为出现疑似细菌性疾病症状（如细菌性花叶或褐色叶斑）的禾谷类植物。细菌分离采用酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂（YPGA）培养基，按照标准程序进行。从植物组织或种子样品中分离出细菌菌株，并进行纯化保存。

表型鉴定

所有分离得到的细菌菌株均进行了标准生化测试，包括革兰氏染色、好氧/厌氧生长测试、在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基上的生长情况以及在酵母提取物-葡萄糖-碳酸钙（YDC）琼脂培养基上的菌落特征观察。以Clavibacter tessellarius的模式菌株CFBP 3496^T作为阳性对照。

致病性测定

所有细菌菌株均在温室条件下接种到小麦（品种Azadi）、大麦（品种Rihane）和燕麦植株上，评估其致病性。菌悬液浓度调整为1×10⁸ CFU/mL，采用无菌胰岛素注射器注射到完全展开的叶片中。接种后的植株在温室条件下保持85%–90%的相对湿度，定期观察症状发展直至接种后三周。以C. tessellarius（CFBP 3496^T）和C. michiganensis（ICMP 2550^T）分别作为阳性和阴性对照。通过从出现症状的植株上重新分离病原菌并验证其形态学和分子特征（使用Clavibacter特异性引物CMR16F1/CMR16R1）来完成柯赫氏法则。

分子系统发育分析

采用多基因座序列分析（MLSA），对四个看家基因（atpD、gyrB、ppk和recA）进行测序和系统发育树构建。使用MEGA 7.0软件，基于最大似然法和通用时间可逆（GTR）模型进行 phylogenetic tree 构建，bootstrap值设置为1,000次。从不同系统发育簇中选择代表性菌株进行全基因组测序，以阐明其精确分类地位、基因组特征和毒力因子 repertoire。使用JSpeciesWS、ANI calculator和OrthoANIu等工具计算平均核苷酸一致性（ANIb），并通过Genome-to-Genome Distance Calculator在线服务计算数字DNA-DNA杂交（dDDH）值。使用pyANI v0.2.11 Python流程生成基于ANI矩阵的双层次聚类热图。此外，通过一对一BLASTn/BLASTp搜索，比较了与Clavibacter致病性相关的毒力基因（如低G+C致病性岛上的chp和tomA基因簇）在分离菌株基因组中的存在情况。

抗生作用与细菌素产生

采用培养平板法评估所有分离菌株以及相关植物病原棒状细菌的模式菌株/参考菌株的细菌素产生能力和对抗菌化合物的敏感性。将潜在生产者菌株点种在培养基上培养24小时后，喷洒指示菌株的菌悬液，48小时后观察并测量抑制圈的大小。

结果

菌株分离与鉴定

从伊朗多个省份的禾谷类作物（小麦、大麦、燕麦）中分离到25株Clavibacter菌株，其中19株来自小麦，3株来自大麦，3株来自燕麦。这些菌株在YDC培养基上形成橙色至桃红色色素、圆形、凸起、有光泽且边缘整齐的菌落（直径2–4 mm）。所有菌株经Clavibacter特异性PCR引物验证确认为该属成员。

症状与致病性

田间感染的禾谷类作物叶片上出现黄色病斑，边缘不清晰，呈花叶状。小型病斑有时融合成条纹状，症状多出现在植株上部叶片（旗叶）。严重感染的叶片变褐、干枯。人工接种试验表明，所有25株菌均能在其分离寄主上诱发症状（轻微 discoloration、黄化、组织坏死），初始症状在接种后3–5天出现。病原菌不会在同一植株的未接种组织或邻近植株间传播。

系统发育分析

基于MLSA和全基因组测序的系统发育分析表明，25株Clavibacter菌株可分为五个不同的谱系。其中16株归属于C. tessellarius（15株来自小麦，1株来自大麦）；3株归属于C. zhangzhiyongii（分别来自大麦和燕麦）；其余6株菌（Sh2036, Sh2126, Sh2088, Sh3027, Sh2141, Sh3038）形成了三个新的系统发育簇，与所有已描述的Clavibacter物种均不同。ANIb和dDDH分析证实，这三个新簇与已知物种的ANI值均低于95%，dDDH值低于70%，表明它们代表三个假设的新物种。

基因组比较与毒力因子

全基因组比较分析显示，五个Clavibacter谱系的大多数毒力相关基因组内容相似。唯一 noticeable 的差异体现在expA、pgaA和sbtA基因上，这些基因在不同系统发育簇间存在变异。

抗生作用

抗生作用测试表明，C. zhangzhiyongii菌株对其 encountered 的棒状细菌物种抑制作用最强，其次是C. tessellarius。菌株Fas2、Sh3031（C. tessellarius）和Sh3027（新簇成员）对 encountered 菌株产生的抗菌化合物最不敏感。Rathayibacter tritici的模式菌株CFBP 1385^T则最为敏感。

讨论

本研究评估了伊朗禾谷类作物上伴生的Clavibacter菌株的地理分布、致病性和分类多样性。系统发育分析结果表明，大多数菌株属于C. tessellarius，部分为C. zhangzhiyongii，另有六个菌株代表三个假设的新物种。这表明与禾谷类作物相关的Clavibacter种群在分类学上分散于至少五个独立的物种中。

Clavibacter属与寄主植物的共进化关系值得关注。例如，番茄、马铃薯、辣椒和玉米起源于美洲，而与之相关的C. nebraskensis、C. michiganensis、C. californiensis和C. phaseoli也最初描述于美洲。相反，苜蓿、大麦和小麦起源于中东和肥沃新月地带。本研究发现，与禾谷类作物相关的Clavibacter物种的多样性中心与其寄主植物的驯化中心（伊朗高原）相吻合。

一个遗留的问题是，为何C. tessellarius最早发现于美国，而不是其寄主植物的驯化中心。这可能源于伊朗植物细菌学研究起步较晚，以及该类病原菌是生长缓慢的微生物，需要富集半选择性培养基才能进行体外培养，在普通培养基上易被腐生微生物或其他病原菌（如Xanthomonas translucens） outcompeted。推测C. tessellarius可能是通过受感染的小麦种子从伊朗高原传入新世界，并且在美国经历了近期瓶颈后的种群扩张。类似的情况也发生在小麦细菌性条斑病菌X. translucens pv. undulosa上，其模式菌株LMG 892^PT分离自美国的一种名为“Khorasan wheat”的二粒小麦品种，而该品种的名称指向伊朗东北部的呼罗珊省，暗示了其起源于伊朗高原的古代文明。

结论

本研究的数据提出了禾谷类作物（小麦、大麦和燕麦）上的Clavibacter病原体的高度多样性与这些植物的驯化中心之间存在相关性。Clavibacter物种在北美和中国的零星发生更可能是通过受感染的小麦和大麦种子传播的结果。尽管在伊朗高原存在一个分类学上复杂的Clavibacter种群（包括五个独立物种），但仅C. tessellarius和C. zhangzhiyongii分别在美国和中国被报道。了解这些病原体的演化中心对于植物病害管理和国际检疫事务至关重要。在病原体的多样性中心而非引入地，发现能够控制该病原体的天敌的概率更高。此外，了解植物病原体的起源和多样性中心有助于理解其地理分布路径或减少重复的国际引入事件。