枯草芽孢杆菌抑制蛋白在膜内互作阻断胞内蛋白酶SpoIVFB活性的机制研究及其在病原菌孢子形成中的调控意义

本综述深入探讨了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中膜内蛋白酶（IP）SpoIVFB的调控机制，重点揭示了其天然抑制蛋白BofA和SpoIVFA通过膜内相互作用形成的抑制复合体结构。研究采用体内二硫键交联技术，首次证实BofA C端区域与SpoIVFA跨膜段（TMS）的直接邻近作用，为理解金属离子依赖型IP的活性调控提供了关键实验证据。该机制对多种病原性芽孢杆菌的孢子形成（endosporulation）及毒力调控具有广泛意义，为针对SpoIVFB活性的药物开发（如靶向BofA-SpoIVFA互作的小分子调节剂）奠定了理论基础。

　　

INTRODUCTION

调控性膜内蛋白酶切（RIP）通路在生命三域中广泛参与关键生物学过程的调控。该通路的核心组分膜内蛋白酶（IP）能够直接在膜内切割底物，释放出的蛋白片段可调控细胞功能。以人类S2P蛋白酶为代表的金属IP参与胆固醇稳态、内质网应激反应等过程，而细菌中的S2P相关金属IP（如枯草芽孢杆菌的SpoIVFB）则调控应激反应、致病性及孢子形成等。在孢子形成过程中，SpoIVFB负责切割前体σ因子Pro-σ^K，释放出成熟转录因子σ^K，从而启动母细胞中孢子形成相关基因的转录。SpoIVFB的活性受到两个天然抑制蛋白BofA和SpoIVFA的严格控制，二者与SpoIVFB形成复合体，阻止Pro-σ^K的切割。然而，这一抑制机制的结构基础尚未明确。

RESULTS

BofA C端区域与SpoIVFA跨膜段在抑制复合体中邻近

基于前期结构模型的预测，BofA C端区域（含两个短α螺旋连接一个转角）与SpoIVFA的跨膜段（TMS）可能发生近距离相互作用。为验证这一假设，研究采用体内二硫键交联技术，在大肠杆菌（Escherichia coli）中共表达单半胱氨酸（Cys）变体的MBPΔ27BofA（或全长BofA）与SpoIVFA，以及无Cys的SpoIVFB和Pro-σ^K(1-127)。氧化剂Cu²⁺(phenanthroline)₃处理可促进邻近Cys间形成二硫键，通过免疫印迹检测交联复合体。

实验结果显示，SpoIVFA变体V84C与BofA变体T65C、V81C或I86C之间均可形成特异性交联复合体（分子量约75 kDa或39 kDa），且该交联可被还原剂DTT部分逆转。阴性对照（如H65C SpoIVFA与T65C BofA）则无交联信号。这些结果证实BofA C端区域（尤其是T65、V81、I86等残基）与SpoIVFA TMS（V84、S87、A88等残基）在膜内存在直接邻近作用，支持了前期关于BofA异常膜内结构与SpoIVFA互作的预测。

氧化剂滴定揭示交联形成能力差异

通过滴定不同浓度氧化剂（1 mM至0.1 μM Cu）并缩短处理时间（5分钟），研究进一步评估了各交联对的相对形成能力。结果表明，BofA C端末端（V81、I86）与SpoIVFA TMS末端（V84、A88）的交联在低浓度氧化剂下仍稳定形成，而T65C BofA与V84C SpoIVFA的交联则需要较高浓度氧化剂，提示后者互作可能较弱或取向相对不利。这一梯度实验排除了非特异性弱信号，突出了关键互作界面的可靠性。

与AlphaFold预测模型的比较

研究利用AlphaFold-2 Multimer及AlphaFold-3对四蛋白复合体（SpoIVFB-BofA-SpoIVFA-Pro-σ^K）进行了结构预测。多数预测模型未将BofA TMS2置于SpoIVFB活性位点 cleft 内，而是提示SpoIVFA的膜外环区可能阻塞底物进入通道。尽管AlphaFold预测了BofA C端与SpoIVFA TMS的邻近（如V81与V84 C_β距离4.5–8.7 ?），但其对T65与V84间距的预测（17.8 ?）与交联实验结果不符，表明现有计算模型仍存在不确定性，需结合实验数据修正。

DISCUSSION

BofA C端采用异常膜内结构

早期研究基于疏水性分析推测BofA C端可能形成第三段TMS，但后续拓扑分析提示该区域可能部分环入膜内。近期计算模型支持BofA C端由两段短α螺旋通过保守的G(L/I/V)PG转角连接，形成膜内嵌入结构，其N端和C端位于膜表面附近。本研究的交联实验为该模型提供了直接证据，并表明该结构对SpoIVFB抑制功能至关重要。

BofA-SpoIVFA互作对抑制功能的关键性

突变分析显示，BofA C端残基（如G75、C端疏水斑块）的替换或缺失会破坏SpoIVFB抑制功能，可能与SpoIVFA互作受损相关。本研究发现BofA C端末端疏水残基（V81、I86等）与SpoIVFA TMS的疏水面通过范德华力相互作用，不仅稳定了抑制复合体，还可能协助SpoIVFA招募BofA至SpoIVFB。此外，较弱的T65C-V84C交联提示BofA TMS2可能间接参与活性位点阻塞，但该互作在生理条件下的贡献需进一步验证。

不同菌株中SpoIVFB抑制机制的演化

系统发育分析表明，spoIVFB基因在厚壁菌门（包括产孢子与非产孢子菌）中广泛分布，而bofA和spoIVFA同源基因的分布则较窄。在缺乏SpoIVFA的梭菌（如Clostridium botulinum）中，BofA可能单独抑制SpoIVFB，这为针对不同病原菌设计特异性抑制剂提供了思路。

应用前景：靶向互作界面的调节剂开发

研究揭示的BofA-SpoIVFA膜内互作界面为开发调控SpoIVFB活性的小分子药物提供了新靶点。增强或削弱该互作可分别促进或抑制孢子形成，对于控制炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等病原菌的孢子存活性与毒力具有潜在治疗价值。

MATERIALS AND METHODS

研究使用定制质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达，通过二硫键交联（氧化剂Cu²⁺(phenanthroline)₃处理）、免疫印迹（抗SpoIVFA、抗MBP抗体）及AlphaFold结构预测等技术手段进行分析。所有蛋白变体均经功能验证（如Pro-σ^K切割抑制实验），确保其生理相关性。