胞内谷氨酰胺水平波动响应氮源调控非结核分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）生物膜形成

本研究发现非结核分枝杆菌（NTM）生物膜形成的关键代谢调控节点：胞内谷氨酰胺（glutamine）作为氮源可利用性的感应器，直接调控细菌聚集（aggregation）这一生物膜形成初始步骤。通过转座子筛选和代谢组学分析，研究揭示了嘌呤/嘧啶生物合成途径中依赖谷氨酰胺的氨基化反应基因突变导致聚集缺陷，且谷氨酰胺池大小与浮游生长正相关。这一发现为靶向代谢感应器（flux-dependent sensors）的抗生物膜治疗策略提供了新思路。

　　

非结核分枝杆菌生物膜形成的代谢调控机制

非结核分枝杆菌（NTM）能够在人类感染和家庭管道系统中形成生物膜，理解其调控机制有助于更好地治疗和预防NTM感染。葡萄糖在体外驱动NTM聚集，而铵离子抑制聚集，但控制生物膜形成这一早期步骤的调控系统尚未明确。本研究以模式NTM生物耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）为对象，揭示了多种碳氮源对聚集的类似影响，表明细菌可能通过下游整合信号感知营养状态。

多种碳氮源影响耻垢分枝杆菌聚集

在富含营养的TYEM培养基中，耻垢分枝杆菌先形成聚集体，随后自发分散。添加葡萄糖延长并增强了聚集阶段，而添加铵盐导致早期分散和浮游生长。研究测试了四种不同碳源（葡萄糖、甘油、丙酮酸、琥珀酸）和两种氮源（铵盐、硝酸盐）的影响，发现所有碳源均增加聚集并延迟浮游生长，而两种氮源均触发分散，表明细菌并非特异性感知外部营养源，而是通过整合代谢节点间接感知碳氮可利用性。

转座子筛选鉴定控制聚集的代谢节点

为识别这些假定调控节点，研究使用phiMycoMarT7噬菌体进行了转座子突变筛选。野生型耻垢分枝杆菌在TYEM琼脂平板上形成皱纹状菌落，这与液体培养中的聚集相关。通过视觉筛选菌落形态变化的突变体，并验证其液体培养中的聚集表型，最终获得133个独立转座子插入突变体。其中超过11%的突变位于糖肽脂（GPL）生物合成基因中，已知这些基因突变导致组成型聚集。作为概念验证，敲除gap（GPL转运蛋白）基因导致组成型聚集和粗糙菌落形态。

特定嘌呤生物合成基因突变抑制聚集

手动审查突变体列表时，发现多个嘌呤和嘧啶生物合成基因的突变。五株突变体涉及嘌呤生物合成（三株purF，一株purL，一株purQ），三株涉及嘧啶生物合成（两株carB，一株carA）。研究聚焦于嘌呤生物合成途径，构建了purF缺失突变体（ΔpurF）。ΔpurF在TYEM中显示平滑菌落形态和聚集缺陷，但生长未受影响，可能因为酵母提取物提供了充足嘌呤。回补野生型purF恢复了野生型聚集表型。然而，添加腺苷和鸟苷（可恢复ΔpurF在确定培养基中的生长）并不影响ΔpurF或野生型的聚集，表明嘌呤本身并非直接调控因子。

筛选命中点集中在利用谷氨酰胺的氨基化酶

深入分析发现，PurF和PurLQS复合物催化嘌呤生物合成中仅有的两个氨基化反应，均使用谷氨酰胺作为氮供体。嘧啶生物合成中命中的carA和carB编码的酶复合物也催化唯一使用谷氨酰胺作为胺供体的反应。另一命中点位于Glu-tRNA^Gln酰胺转移酶，同样使用谷氨酰胺作为氮源。总计，133个测序命中中有9个（>6%）映射到编码使用谷氨酰胺作为氮源的氨基化酶的基因。谷氨酰胺是细菌氮调控的核心，其胞内池随氮可利用性增加而膨胀，在氮缺乏条件下收缩。大多数细菌氮响应调节子直接或间接感知胞内谷氨酰胺。

设计确定培养基评估谷氨酰胺作用

为直接测试氮可利用性、胞内谷氨酰胺和聚集减少之间的相关性，研究设计了M63确定培养基。以丙酮酸为主要碳源和铵盐为主要氮源时，耻垢分枝杆菌以浮游细胞生长；以甘油为主要碳源和谷氨酸为唯一氮源时，支持聚集生长。在含20 mM葡萄糖和20 mM谷氨酸的M63中，聚集动态与丰富培养基相似，具有明显的聚集和分散阶段。添加20 mM NH₄Cl阻止聚集，导致仅浮游生长。菌落生物膜和浮膜生物膜在无铵条件下皱纹更多。研究还在添加牛血清蛋白的M63中验证了脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）平滑菌落临床分离株（0253a）在添加铵盐时聚集减少，表明M63葡萄糖适用于评估NTM生物膜形成中氮的作用。

胞内谷氨酰胺随氮可利用性波动并调控聚集动态

通过靶向液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）测量对数生长期细胞的胞内谷氨酰胺水平，发现添加NH₄Cl时谷氨酰胺池增加，支持较大谷氨酰胺池与减少聚集相关的假设。作为对照，α-酮戊二酸（AKG）水平未变化，尽管其在某些物种中响应氮可利用性调控细胞过程。为探究胞内谷氨酰胺与减少聚集的因果关系，研究通过遗传操作改变胞内谷氨酰胺水平。聚焦于GarA，一个包含叉头关联结构域的蛋白，其基于磷酸化状态结合并影响AKG-谷氨酸-谷氨酰胺节点中的多个酶。ΔgarA突变体在生长阶段具有人工扩大的谷氨酰胺池，预测其聚集少于野生型。确实，ΔgarA突变体在M63葡萄糖中显示高胞内谷氨酰胺池，即使无NH₄Cl添加也仅以浮游细胞生长。回补garA部分挽救了早期聚集，但聚集体过小或脆弱无法定量。菌落形态再次镜像聚集表型。这些结果支持模型：胞内谷氨酰胺池响应氮可利用性波动并抑制耻垢分枝杆菌聚集。

耻垢分枝杆菌聚集动态不受MSDGC-1缺失影响

尽管许多细菌利用c-di-GMP调控生物膜形成，但其在分枝杆菌生物膜中的作用不明。耻垢分枝杆菌仅编码一种处理c-di-GMP的酶MSDGC-1（MSMEG_2196，同时具有GGDEF和EAL结构域）。为确定c-di-GMP信号是否在聚集动态中起作用，研究构建并表型分析了MSMEG_2196突变体。野生型和ΔMSMEG_2196在M63葡萄糖中类似聚集，并在添加NH₄Cl时以浮游细胞生长，表明c-di-GMP对于耻垢分枝杆菌氮依赖性聚集调控非必需。

讨论与未来方向

NTM感染（如由脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌引起）难以用抗生素有效治疗，生物膜形成导致抗生素耐受性增加。长疗程治疗引起众多副作用，包括氨基糖苷类的显著耳毒性。体外药物敏感性测试与临床疗效之间的脱节可能由生理耐受机制（包括生物膜形成）导致。生物膜分散剂与抗生素联用可显著改善动物模型中的细菌感染治疗。

分枝杆菌生物膜调控仍知之甚少。主要障碍是分枝杆菌在大多数液体培养基中组成型聚集，导致普遍教条认为分枝杆菌不作为自由生活浮游细胞生长。在生物膜发展的简单模型中，浮游细胞首先相互粘附和/或粘附表面，然后聚集体进一步发展为成熟生物膜。在组成型聚集范式下，已经存在NTM生物膜中的信号、基因和基因产物，或生物膜成熟所必需的要素，已被探索和描述。例如，参与分枝菌酸生物合成的专用伴侣GroEL1是耻垢分枝杆菌生物膜成熟所必需。糖肽脂（GPLs）影响生物膜稳健性，并可被特定环境线索（如氧气）调控。生物膜在低铁和低镁下形成，但补充这些营养素允许更稳健的生物膜。然而，无实验可及的浮游状态，生物膜形成的第一步（浮游细胞与聚集体之间的转变）尚未在NTM中得到很好研究且理解不足。

碳氮可利用性控制耻垢分枝杆菌和脓肿分枝杆菌中浮游：聚集体转变的最新发现允许探索这一节点，预期将揭示新型NTM调控系统和抗生物膜治疗靶点。可能分枝杆菌中存在典型生物膜调控系统，但由于研究浮游：聚集体转变的困难而未能完全描述。然而，分枝杆菌聚集的不寻常方面（即分枝菌膜组件至少部分作为生物膜基质，且分枝杆菌在大多数液体培养基中容易聚集）迫使我们认为生物膜调控可能是分枝杆菌中与其他细菌根本不同的过程。例如，可能不存在生物膜专用的转录调节子。在这种情况下，如果特定通量依赖代