铜绿假单胞菌分泌的呼吸毒素HQNO通过脂肪酸积累抑制金黄色葡萄球菌SaeRS双组分系统调控的毒力因子表达

本研究揭示了囊性纤维化患者气道中共存的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）通过分泌呼吸毒素2-庚基-4-喹啉N-氧化物（HQNO）抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）呼吸作用，诱导脂肪酸积累，进而负向调控SaeRS双组分系统（TCRS）依赖的毒力基因转录的分子机制，为靶向细菌群体感应和毒力表达的抗感染策略提供了新视角。

　　

ABSTRACT

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是定植于囊性纤维化（CF）患者气道中的两种主要病原体。随着年龄增长，P. aeruginosa 逐渐取代 S. aureus 成为气道中的优势菌种，此过程与患者症状恶化相关。这种负相关性部分源于 P. aeruginosa 分泌的次级代谢产物和毒力因子对宿主细胞及其他细菌的拮抗作用。其中多种代谢物能抑制 S. aureus 的呼吸作用。SaeRS 是 S. aureus 中的一个双组分调控系统（TCRS），负责调控众多毒力基因的转录。SaeRS 调控基因的转录会随着呼吸状态的改变而下降，而细胞内脂肪酸的积累也会负向影响 SaeRS 的活性。将 S. aureus 与 P. aeruginosa 的无细胞条件培养液共培养后，SaeRS 系统的转录输出降低。通过使用 P. aeruginosa 突变株和化学遗传学方法进一步分析，确定2-庚基-4-喹啉 N-氧化物（HQNO）是导致 SaeRS 依赖性基因调控改变的原因。HQNO 处理增加了细胞相关脂肪酸的丰度。HQNO 抑制细胞呼吸，并且在一个呼吸受损、会积累脂肪酸的 S. aureus 菌株中，SaeRS 系统对 HQNO 处理没有反应。这些数据与一个工作模型相符：用 HQNO 处理 S. aureus 会抑制其呼吸作用，增加游离脂肪酸的积累，从而负向影响 SaeRS 信号传导，最终导致 SaeRS 调节子（其在发病机制中具有重要作用）的表达降低。

IMPORTANCE

铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌经常从囊性纤维化患者的气道中共同分离出来。铜绿假单胞菌分泌非必需的代谢物来改变金黄色葡萄球菌的生理状态，从而获得竞争优势。金黄色葡萄球菌可以适应这些代谢物的存在，但其用于感知这些铜绿假单胞菌产生的代谢物和/或由此诱导的生理变化的遗传机制在很大程度上是未知的。金黄色葡萄球菌的 SaeRS 双组分调控系统正向调控多种毒力因子的表达，包括毒素和蛋白酶，这些因子有助于在恶劣的宿主环境中适应和生存。本研究证明，铜绿假单胞菌产生的呼吸毒素2-庚基-4-喹啉 N-氧化物（HQNO）能抑制呼吸作用，降低 SaeRS 调控基因的转录，从而减少毒力因子的产生。这些发现可用于降低金黄色葡萄球菌在各种感染环境中表达毒力因子的能力。

INTRODUCTION

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种共生细菌，大约30%人群的鼻腔中可以发现它。它通常引起轻微的皮肤感染，但也可导致更严重和侵袭性的疾病，如肺炎、骨髓炎、心内膜炎和败血症。抗生素的使用和滥用增加了耐抗生素金黄色葡萄球菌分离株的数量，减少了治疗策略的选择，这是一个日益令人担忧的问题。

金黄色葡萄球菌是定植于囊性纤维化（CF）患者气道和肺部的主要细菌之一。虽然铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在实验室和CF肺部中可以竞争胜过金黄色葡萄球菌，但据信铜绿假单胞菌在感染期间能从共存中获益。铜绿假单胞菌分泌的次级代谢物会改变金黄色葡萄球菌的生理状态，包括抑制呼吸作用。2-庚基-4-喹啉 N-氧化物（HQNO）是由铜绿假单胞菌 pqsABCDE 操纵子表达产生的一种主要次级代谢物。据推测，HQNO 可阻断金黄色葡萄球菌呼吸链中细胞色素氧化酶和 NADH 脱氢酶的氧化还原。呼吸抑制导致金黄色葡萄球菌转向发酵代谢以产生能量和平衡氧化还原，这导致其分泌乳酸，而乳酸是铜绿假单胞菌偏好的碳源。

金黄色葡萄球菌利用转录调控系统，包括双组分调控系统（TCRS），来感知并响应环境和内部压力。TCRS 通常由组氨酸激酶传感器和响应调节器组成，后者在磷酸化后对DNA的亲和力发生改变。金黄色葡萄球菌外蛋白调节因子（Sae）TCRS 控制着许多毒力因子的表达。Sae TCRS 由跨膜组氨酸激酶 SaeS 组成，它具有自磷酸化活性，并作为响应调节器 SaeR 的磷酸供体。SaeR 的磷酸化正向调控几种编码毒力因子的基因的转录，包括α-毒素（hla）、杀白细胞素（lukF）、蛋白酶和其他免疫逃避因子。Sae 还利用两种辅助蛋白，即跨膜蛋白 SaeQ 和细胞外脂蛋白 SaeP。SaePQ 可以与 SaeS 相互作用并激活其针对 SaeR 的磷酸酶活性。saePQRS 操纵子的转录由 saeP1 启动子控制，该启动子有两个已知的 SaeR 响应调节器结合位点。

尽管 SaePQRS 系统的直接刺激物尚不清楚，但游离脂肪酸水平的增加会负向影响 SaeRS 依赖性转录。我们先前证明，在发酵生长期间 SaeRS 依赖性调控输出会发生改变，这表明呼吸状态直接或间接地改变了 SaeRS 的活性。通过引入 NADH 氧化酶基因（ndhC）突变对金黄色葡萄球菌呼吸进行遗传抑制，降低了溶血活性。加入牛血清白蛋白（BSA）（它能结合并降低细胞可接触的脂肪酸浓度）后，溶血增加。这两种表型都依赖于 SaeRS，这引出了一个先前未经检验的假设：呼吸抑制时脂肪酸会积累并导致 SaeRS 活性降低。

本手稿检验了以下假设：一种或多种铜绿假单胞菌分泌的次级代谢物抑制金黄色葡萄球菌的呼吸作用，导致脂肪酸积累和 SaeRS 依赖性转录减少。在一篇配套手稿中，我们证明了铜绿假单胞菌分泌的 HQNO 在本文使用的生长条件下抑制金黄色葡萄球菌的呼吸。在本手稿中，我们证明呼吸抑制增加了脂肪酸的积累，从而导致 SaeRS 依赖性转录减少。这些发现增加了我们对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌相互作用的认识，并且也表明 HQNO 可用于减少 SaeRS 依赖性基因调控，这对于表达和分泌众多金黄色葡萄球菌毒力因子非常重要。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and culture conditions

使用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）和琼脂（TSA）培养基。细菌菌株在37°C、200 rpm振荡的10 mL培养管中的2 mL TSB中好氧生长。HQNO 用二甲基亚砜（DMSO）配制为5 mg mL^-1储备液。为评估 HQNO 的影响，菌株在37°C培养8小时，添加或不添加5 μg mL^-1 HQNO、油酸（0.005% wt/vol）和/或 BSA（10 μg mL^-1）。使用 Centricon-10（10,000 MW cutoff）过滤器检查 BSA 与 HQNO 结合的可能性。在选择质粒或染色体插入时，添加氯霉素（Cm，30 μg mL^?1）、红霉素（Erm，10 μg mL^?1）或四环素（Tet，5 μg mL^?1）。使用10 μg mL^?1氯霉素维持质粒。

Bacterial strains and plasmids

本研究使用的所有质粒和菌株列于表1。使用噬菌体80α进行转导。通过PCR或测序（Azenta公司）验证菌株和质粒。DNA引物从Integrated DNA Technologies公司购买（表2）。为创建 pOS_hla_gfp 转录报告质粒，使用 Phusion 聚合酶扩增 hla 启动子，产物经凝胶纯化后，用 Quick Ligase 酶连到同样酶切的 pOS_saeP1_gfp 上，连接产物转化至大肠杆菌 DH5-α 细胞，并在含100 μg mL^?1氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选生长。通过PCR和测序验证克隆。

使用酵母重组克隆技术构建 pJB38_Δcyd 和 pJB38_Δqox::tet 质粒。为生成 pJB38_Δqox::tet 载体，使用 pJB38_ΔcopAZ 和特定引物对扩增酵母克隆盒、qox 的上游和下游区域以及 tet 基因。通过等位基因替换产生突变体。pJB38_Δndh2b::tet 质粒的构建如前所述，扩增 ndh2b 的上游和下游区域，消化后连接到同样酶切的 pJB38 中，创建 pJB38_Δndh2b。然后从菌株 JMB1432 中扩增 tetM 等位基因，消化后连接到经 NheI 和 MluI 消化的 pJB38_Δndh2b 中，创建 pJB38_Δndh2b::tet。

Transcriptional reporter assays

含有转录报告基因的 S. aureus 菌株在含10 μg mL^-1 Cm 的 TSB 中过夜培养，然后稀释至 A₆₀₀=0.1，在10 mL 培养管中的2 mL TSB-Cm 中一式三份培养。saeRS 在 tetRO xylR 转录控制下的菌株需补充2%（wt/vol）木糖。生长8小时后，将每个样本的200 μL 加入黑色96孔板，使用 Varioskan Lux 酶标仪在488 nm激发、510 nm发射、12 nm光程下测量荧光。将 HQNO（5 μg mL^-1）和/或油酸（0.005%）和/或 BSA（10 μg mL^-1）添加到样本中，培养8小时后定量所有培养物的 Gfp 荧光。

为生成 P. aeruginosa 条件培养基，将菌株在30 mL 培养管中的3 mL LB 肉汤中过夜培养。离心收集上清液并过滤除菌。将100 μL 铜绿假单胞菌无细胞条件培养基加入2 mL 金黄色葡萄球菌培养物中。

对于添加脂肪酸的实验，过夜培养物一式三份稀释至 A₆₀₀=0.1，置于10 mL 培养管中的2 mL 含10 μg mL^?1 Cm 的 TSB 中。细胞生长至 A₆₀₀=1 时，准备三组一式三份样本：一组加5 μg mL^?1 HQNO，一组加0.005%油酸，一组同时添加 HQNO 和油酸。细胞在37°C、200 rpm 恒定振荡下再培养2小时，然后测量荧光。所有转录报告实验的样本荧光均按测定时的个体培养物光密度（A₆₀₀）进行标准化。

Hemolysis assays

细菌培养物在添加或不添加5 μg mL^?1 HQNO 的 TSB 中一式三份过夜培养。将培养物标准化至 A₆₀₀=0.1，置于1 mL PBS 中。将此PBS/条件培养基混合物在13,000 × g 离心1分钟，取上清液并过滤除菌。制备1%兔血细胞（脱纤维）溶液：取15 μL 血液，在1,700 × g 离心5分钟，弃上清，小心地将红细胞重悬于1 mL PBS 中。重复洗涤和重悬步骤三次，最后将红细胞重悬于1.5 mL PBS 中。实验在96孔板中进行：加入50 μL 红细胞溶液和50 μL 无细胞培养上清液。如前所述，每15分钟测量一次 A₆₀₀，持续2小时。将裂解曲线的线性部分（至少包含四个数据点）拟合为最佳拟合线，裂解速率报告为每分钟吸光度的下降值。

Quantification of intracellular fatty acids

将菌株在 TSB 中过夜培养，一式三份稀释至 OD₆₀₀=1，置于30 mL 玻璃培养管中的5 mL TSB 中，添加或不添加5 μg mL^?1 HQNO。记录培养12小时后的密度，并将细胞置于冰上。将相当于10个光密度单位（A₆₀₀）的细胞转移至15 mL 锥形离心管中，离心收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于1.5 mL PBS 中，并转移至2 mL 离心管。细胞在13,000 × g 离心1分钟，重悬于300 μL 含有0.1 mm 硅玻璃珠的1%（vol/vol）Triton X-100 氯仿溶液中。使用 FastPrep 匀浆器进行珠磨破碎（两个循环，每个40秒，6.0 m/s）以裂解细胞。离心去除不溶性碎片。收集等量的各样本有机相，转移至1.5 mL 离心管。脂质在50°C通风橱中风干1小时以去除氯仿。将干燥的脂质溶解于100 μL 测定缓冲液中，剧烈涡旋5分钟。使用游离脂肪酸定量试剂盒（Sigma-Aldrich）荧光法测定每个样本的游离脂肪酸浓度。室温下使用黑色96孔板在 Varioskan Lux 酶标仪上测量荧光，激发波长535 nm，发射波长587 nm，光程12 nm。

RESULTS

P. aeruginosa conditioned media alters SaeRS-dependent transcriptional activity

我们先前证明末端电子受体的缺失会改变 SaeRS 调控输出。铜绿假单胞菌分泌的次级代谢物能抑制金黄色葡萄球菌的二氧呼吸。我们检验了铜绿假单胞菌分泌的次级代谢物改变 SaeRS 依赖性调控活性的假设。金黄色葡萄球菌的 hla 编码α-溶血素，这是一种由 SaeR 直接调控的毒力因子和细胞毒素。为监测 hla 转录活性，我们将 gfp 置于 hla 启动子的转录控制下，从而可以通过测量荧光来指示 hla 转录输出。

将铜绿假单胞菌 PA14（PA14）在 LB 培养基中培养，收集、灭菌并保留无细胞条件 LB 培养基。将此无细胞条件 LB 培养基添加到含有 hla 转录报告基因的金黄色葡萄球菌 USA300_LAC（野生型或 WT）及其同基因 ΔsaeRS 突变体的液体培养物中，并定量荧光。与 PA14 条件培养基共培养后，hla 转录活性显著降低。ΔsaeRS 突变体中的 hla 转录活性低于检测限，证实 hla 转录需要 SaeR。添加 LB 培养基后，WT 菌株的转录输出与未添加对照组表型相同，表明金黄色葡萄球菌对一种或多种 PA14 产生的代谢物有反应。

金黄色葡萄球菌的 saeP1 操纵子控制 saePQRS 操纵子的转录活性。磷酸化的 SaeR 与 saeP1 操纵子中的两个位点结合，诱导 saePQRS 的转录。使用荧光转录报告基因，我们在添加 PA14 条件培养基后，定量了 WT 和 ΔsaeRS 突变体中 saeP1 的转录活性。添加的条件培养基显著降低了 WT 菌株中的 saeP1 转录活性。ΔsaeRS 突变体没有检测到转录活性，证实了其对 SaeR 的依赖性。这些发现与以下假设一致：一种或多种 PA14 分泌的代谢物可以降低 SaeRS 的活性。

The respiratory toxin HQNO stimulates SaeRS

我们试图确定 PA14 条件培养基中哪种次级代谢物改变了 SaeRS 信号传导。我们收集了缺乏产生一种或多种次级代谢物的同基因铜绿假单胞菌突变体的条件培养基。从 PA14 培养物以及缺乏合成吩嗪（Δphz）、氰化氢（Δhcn）或喹诺酮类（ΔpqsABC）的菌株中分离条件培养基。然后将这些条件培养基添加到携带 hla 或 saeP1 转录报告基因的 WT 和 ΔsaeRS 培养物中。虽然来自 PA14 的条件培养基降低了 hla 和 saeP1 的转录活性，但来自 ΔpqsABC 突变体的条件培养基则没有。来自 Δphz 和 Δhcn 菌株的条件培养基显著降低了转录活性，其水平与含有 PA14 培养基的培养物相似。ΔsaeRS 突变体中 hla 和 saeP1 的转录活性低于检测限。这些数据强化了以下假设：PQS 系统产生一种或多种分子，从而减少 SaeRS 依赖性转录调控。

我们试图鉴定由邻氨基苯甲酸产生的哪种次级代谢物改变了 Sae 活性。在 PQS 系统中，pqsL 和 pqsH 基因产物分别负责生产 HQNO 和 PQS。来自 PA14、ΔpqsL 或 ΔpqsH 突变体的条件培养基在不同程度上显著降低了 hla 转录活性，而来自 ΔpqsABC 突变体的条件培养基则没有。与从 PA14 或 ΔpqsH 分离的培养基相比，来自 ΔpqsL 突变体的条件培养基降低 hla 转录的能力减弱。

来自 ΔpqsL 突变体的条件培养基没有改变 saeP1 转录活性，而来自 ΔpqsH 突变体的条件培养基则改变了，但其水平低于 ΔpqsABC 突变体。这些结果导致了一个模型：PqsL 产生的 HQNO 改变了 SaeRS 转录输出，这需要 saeRS 的存在。

我们开始检验 HQNO 改变 SaeRS 依赖性转录活性的假设。将 HQNO 滴定到含有 saeP1 转录报告基因的 WT 菌株中，导致 saeP1 转录活性呈剂量依赖性下降。HQNO 溶解在 DMSO（载体对照）中，添加高达1%的 DMSO 不会改变生长动力学或 saeP1 转录活性。

SaeP 和 SaeQ 与 SaeS 相互作用并促进磷酸酶活性。我们决定测试 HQNO 依赖性 saeP1 转录活性的降低在缺乏 SaeP 或 SaeQ 的菌株（ΔsaeP 和 ΔsaeQ）中是否发生改变。此外，我们还测试了 HQNO 效应是否需要 DNA 结合活性（ΔsaeRS）。ΔsaeP 和 ΔsaeQ 菌株的 saeP1 转录增加，表明磷酸化的 SaeR 更多。ΔsaeRS 突变体中的荧光非常低，证明 saeP 的转录需要 DNA 结合蛋白 SaeR。所有测试的菌株在存在 HQNO 的生长条件下转录活性均降低。

我们检查了 SaeRS 活性的改变是否需要 saeRS 处于 saeP1 启动子的转录控制之下。为此，我们检测了 HQNO 对 saePQRS 处于木糖诱导型启动子（p_xyl/tetO-sae）转录控制下的菌株中 SaeRS 活性的影响。我们使用了含有或不含有 saePQ 的菌株。p_xyl/tetO-sae 菌株中 saeP1 的基础转录活性水平略高于 WT 菌株。在 HQNO 存在下生长时，p_xyl/tetO-sae 菌株的 saeP1 转录活性降低到与 WT 相当的水平。无论 SaePQ 是否存在，这种表型都会发生。

我们还检测了 HQNO 对 WT、ΔsaeP、ΔsaeQ、ΔsaeRS 和 p_xyl_saeRS 菌株中 hla 启动子活性的影响。在没有 HQNO 的情况下，ΔsaeP 和 ΔsaeQ 突变菌株中 hla 的转录活性与 WT 相比有所增加。hla 的转录活性需要 SaeRS 的存在。在处于木糖诱导型启动子转录控制下的含有 saeRS 的菌株中，转录活性略有增加。在 HQNO 存在下生长降低了所有检测菌株的转录。图3B和C中的数据表明，由添加 HQNO 引起的 SaeRS 活性变化不是 saeRS 转录改变的结果，而是 SaeRS 刺激改变的结果。

接下来我们检查了 HQNO 对 hla 表达的影响。我们在存在和不存在 HQNO 的情况下培养 WT、hla::Tn 和 ΔsaeRS 菌株，分离条件培养培养基，然后定量该条件培养基裂解红细胞的能力，这与存在的 Hla 数量相关。使用 WT 条件培养基进行的测定中，溶血速率随着共培养中包含的 HQNO 浓度增加而下降。使用从 hla::Tn 或 ΔsaeRS 菌株分离的条件培养基时，注意到溶血非常少，这与已发表的发现一致。与 HQNO 共培养后，这些菌株的细胞裂解物催化的溶血速率没有改变。这些结果证明 PA14 产生的 HQNO 降低了 SaeRS 依赖性转录输出。

Active respiration is required for HQNO to negatively impact SaeRS-dependent transcription

在一篇配套手稿中，我们证明金黄色葡萄球菌在受到 HQNO 挑战时膜电位降低、二氧消耗速率减少，表明在所使用的生长条件下 HQNO 抑制了呼吸作用。我们检验了细胞必须进行主动呼吸，HQNO 处理才会影响 SaeRS 依赖性转录的假设。金黄色葡萄球菌基因组编码 Cyd 和 Qox 末端氧化酶。我们在存在和不存在 HQNO 的情况下培养含有 saeP1 或 hla 转录报告基因的 WT 和 ΔcydA qoxB::Tn 双突变菌株，并定量转录活性。与 WT 相比，ΔcydA qoxB::Tn 菌株中两个启动子的活性均显著降低。ΔcydA qoxB::Tn 菌株中的转录活性与用 HQNO 共培养的 WT 菌株的转录活性表型相同。在 ΔcydA qoxB::Tn 菌株中，HQNO 对 saeP1 和 hla 的转录没有显著影响。这些数据与以下假设一致：金黄色葡萄球菌必须进行主动呼吸，HQNO 才会对其 SaeRS 转录输出产生负面影响。这也与我们之前的发现一致，即呼吸作用改变 SaeRS 输出。

我们想测试 HQNO 是否在缺乏一种或两种 NADH 脱氢酶（ndh2a, ndh2b）的菌株中改变 saeP1 和 hla 的转录活性。ndh2a 突变（而非 ndh2b 突变）与 WT 相比降低了 saeP1 转录活性。ndh2a::Tn ndh2b::tetM 双突变体与 ndh2a::Tn 单突变体具有相似的效果，表明在所使用的生长条件下 ndh2a 是主要的 NADH 脱氢酶。单突变和双突变 ndh 菌株的处理表型与经 HQNO 处理的 WT 菌株相同。我们使用 hla 转录报告基因重复了这些测定。与 WT 相比，ndh2a::Tn 和 ndh2b::tetM 等位基因均导致 hla 转录活性显著降低，其中 ndh2a::Tn 显示出更强的表型。ndh2a::Tn ndh2b::tetM 等位基因在降低 hla 转录活性方面具有叠加效应。单突变和双突变 ndh 菌株的处理表型与处理的 WT 菌株的 hla 转录输出相同。这些数据证实 SaeRS 转录活性受呼吸状态影响，并证明主动呼吸是 HQNO 处理影响 SaeRS 信号传导所必需的。

Treatment with HQNO increases fatty acid accumulation

SaeRS 的活性随着游离脂肪酸的内源性积累或外源性补充而降低。我们检验了 HQNO 的呼吸抑制会增加脂肪酸水平的假设。我们在培养有或没有 HQNO 的 WT 和 ΔcydA qoxB::Tn 菌株中定量了细胞相关的游离脂肪酸。与 WT 相比，ΔcydA qoxB::Tn 菌株中总脂肪酸的浓度增加。用 HQNO 挑战后，WT 菌株中的游离脂肪酸水平增加，而呼吸缺陷菌株的总游离脂肪酸浓度没有显著差异。重要的是，经 HQNO 处理的 WT 的游离脂肪酸水平与在 ΔcydA qoxB::Tn 菌株中观察到的水平表型相同。

无脂肪酸 BSA 对脂肪酸具有高亲和力，在生长培养基中补充 BSA 会降低培养基中脂肪酸的滴度，改变平衡，从而导致细胞内脂肪酸浓度降低。BSA 对脂肪酸的亲和力随着其碳链长度的增加而增加。我们在含有 saeP1 转录报告基因的 WT 菌株中培养 HQNO 和/或无脂肪酸 BSA。如上所述，与 HQNO 共培养后，saeP1 的转录活性降低；然而，直接将 BSA 添加到培养基中与没有 BSA 的培养物相比显著增加了 saeP1 转录活性。

为确保观察到的表型是 BSA 结合脂肪酸的结果，而不是结合 HQNO，我们将 HQNO、BSA 或 BSA + HQNO 与 TSB 混合，并通过10 kDa 分子量截止过滤器过滤溶液。然后将单独的滤液添加到含有 saeP1 转录报告基因的 WT 培养物中，并定量转录输出。与载体对照相比，过滤的 HQNO 显著降低了 saeP1 转录活性，而过滤的 BSA 溶液则没有。由 BSA + HQNO 产生的滤液降低了 saeP1 转录活性，表明在所检查的条件下 BSA 不会显著结合 HQNO，这与先前的报告一致。

用油酸处理金黄色葡萄球菌会降低 SaeRS 输出。我们检查了 HQNO 处理是否会干扰油酸干扰 SaeRS 信号传导的能力。我们用 HQNO、油酸或两种化合物挑战含有 saeP1 转录报告基因的 WT。用 HQNO 或油酸处理降低了 saeP1 转录活性。同时用 HQNO 和油酸处理对 saeP1 的转录活性具有叠加效应。图5中呈现的数据综合起来与以下假设一致：HQNO 抑制呼吸作用，导致脂肪酸积累，降低磷酸化 SaeR 的浓度，并降低 SaeRS 依赖性转录输出。

DISCUSSION

我们和其他人已经证明，呼吸状态与金黄色葡萄球菌中毒力因子的产生有关，并且 SaeRS 活性受呼吸状态调节。与铜绿假单胞菌共培养的金黄色葡萄球菌细胞的转录谱分析显示，编码几种毒力因子（包括 SaeRS 调控的丝氨酸蛋白酶和杀白细胞素）的基因转录减少。另一项研究发现