基于HiBiT标记假病毒样颗粒平台实现安全快速的病毒中和与抗体依赖性增强作用定量分析

本刊推荐：研究者开发了一种基于HiBiT标记假病毒样颗粒（HiBiT-PsVLPs）的新型中和测定平台，通过NanoBiT分裂荧光素酶系统实现快速（3-24小时）的病毒进入检测。该系统兼具传统假病毒（PNAs）的生物学相关性和替代病毒中和试验（sVNTs）的高安全性，可评估多种病毒（包括SARS-CoV-2、HIV-1、埃博拉等）的中和抗体（NMAbs）效价，并能检测抗体依赖性增强（ADE）效应，为疫苗和抗体药物的开发提供了重要技术支撑。

　　

引言

病毒性疾病暴发的频率随着全球互联性、城市化、气候变化及其他社会经济、环境和生态因素的增长而增加。过去十年间，世界经历了多次流行病，包括2014–2016年西非的埃博拉疫情、2015–2016年美洲的寨卡疫情、COVID-19大流行以及Mpox全球卫生紧急事件。在这些新发病毒暴发的同时，人类免疫缺陷病毒（HIV）、肝炎病毒和流感病毒等既定病原体仍然是全球发病和死亡的主要原因。因此，需要新的对策来应对地方性和新出现的病毒威胁。

单克隆抗体（mAbs）已成为强大的双模式干预措施，在抗病毒防御中具有特殊作用。凭借其高亲和力和特异性，mAbs可以作为有效的预防和治疗剂，且脱靶效应最小。作为预防剂，mAbs可立即提供感染保护，在疫情初期为疫苗诱导的免疫力提供重要补充。这种保护对于高风险人群尤其关键，包括医疗专业人员和感染者的密切接触者。mAbs也可能作为免疫受损个体的补充或替代疫苗接种方案，这些个体不太可能产生保护性疫苗反应。作为治疗剂，mAbs可以降低感染性病毒载量，减少住院和死亡风险，并可能降低传播可能性。

与疫苗接种或感染引发的抗体类似，mAbs通过免疫效应功能（如抗体依赖性细胞毒性）和/或病毒中和发挥其抗病毒活性。中和抗体（nAbs）特异性结合病毒表位，这些表位对受体结合、膜融合、内体逃逸或基因组脱壳至关重要，从而抑制病毒进入。这种阻断感染的能力是中和单克隆抗体（NMAbs）预防和治疗效果的基础。尽管具有抗病毒特性，但病毒特异性抗体在某些情况下可能矛盾地加剧疾病。在其最明确的形式中，这种抗体依赖性增强（ADE）发生在非中和或亚中和抗体结合病毒颗粒并与吞噬细胞上的Fcγ受体（FcγRs）结合时，从而增加病毒摄取、进入和复制。由于中和和ADE对NMAb的功效和安全性至关重要，因此需要 robust 的、反映作用机制（MoA）的方法来测量这些过程，以促进NMAb的开发。

目前存在多种评估中和和ADE的方法，每种方法都有独特的优势和局限性。活病毒检测，如空斑减少中和试验，通常因其生物学相关性而被视为“金标准”。然而，这些检测本质上是低通量的，并且对致病性病毒需要高生物安全防护，且需要多天才能读出结果。因此，通常采用替代方法，包括基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的替代病毒中和试验（sVNTs）和假病毒中和试验（PNAs）。sVNTs测量纯化的病毒受体结合域（RBDs）与其同源受体之间的相互作用。尽管快速且无生物安全限制，但这些检测具有几个关键缺点：它们不能反映病毒进入的全部复杂性，仅捕获那些破坏RBD-受体结合的nAbs，并且无法检测ADE。相比之下，PNAs通过使用带有目标病毒进入蛋白的无复制能力病毒，在生物安全性和生物学相关性之间提供了平衡。这些假病毒重现了病毒进入宿主细胞的过程，允许检测比sVNTs更多样化的抗体MoAs。报告基因，如编码荧光蛋白或荧光素酶的基因，可以包装在假病毒内，用于中和和ADE的定量评估。尽管有这些优势，PNAs仍然带有生物安全风险，包括可能产生复制 competent 病毒和插入突变（即对于基于慢病毒的假病毒）。此外，PNAs需要一天或更多时间才能读出结果。

为了克服现有检测的局限性，我们利用HiBiT蛋白标记系统开发了一种安全、生物学相关的方法来快速量化中和和ADE。HiBiT是一个11个氨基酸的肽标签，以高亲和力与其互补多肽LgBiT结合，重建功能性NanoBiT荧光素酶。通过将HiBiT与HIV-1 Pr55^Gag多蛋白融合，我们衍生出内部包装HiBiT肽的包膜VLPs。这种高度模块化的VLP平台可以用多种病毒糖蛋白进行假型化，以允许细胞进入。将这些HiBiT标记的假病毒样颗粒（HiBiT-PsVLPs）与表达LgBiT的细胞配对，产生了一种发光检测系统，相对于传统的PNAs，具有改进的生物安全性和缩短的周转时间。与sVNTs不同，HiBiT-PsVLP生物检测捕获了除抑制RBD-受体结合之外的MoAs，并能够检测中和和ADE。在此，我们确立了HiBiT-PsVLP平台的可行性和稳健性，并展示了其在针对地方性和新出现病毒的NMAb开发中的广泛适用性。

结果

SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的生产与表征

为了生成HiBiT标记的VLPs，我们将HiBiT融合到HIV-1 Pr55^Gag的C末端。该Gag^HiBiT融合蛋白的瞬时表达在培养上清液中产生了电子致密结构，其大小（约100 nm）和形态与HIV-1 Gag VLPs一致。HiBiT检测试验表明，与分泌的、非包膜对照蛋白（PCSK9^HiBiT）相比，Gag^HiBiT成功包装在包膜VLPs内。

我们接下来试图用SARS-CoV-2 Spike蛋白对Gag^HiBiT VLPs进行假型化。为此，我们共表达Gag^HiBiT和缺乏细胞质尾部的截短Spike蛋白，因为去除该内域已被证明可以改善假型化。免疫印迹证实了Spike的表达和加工，这些不受Gag^HiBiT共表达的影响。在没有Gag^HiBiT的情况下观察到最少的Spike分泌，而在Gag^HiBiT共表达的情况下，分泌增强，主要是加工后的Spike。电子显微镜显示VLPs具有冠状病毒Spike蛋白特有的冠状光环。HiBiT含量 per particle 在三批独立的SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs中是相似的，并且相对于非假型化的Bald HiBiT-VLPs有所增加，表明Spike的掺入并未降低HiBiT的包装效率。综合来看，这些数据证明了成功生产了带有SARS-CoV-2 Spike蛋白假型化的包膜Gag^HiBiT VLPs。

SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的细胞进入

为了测量SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的进入和中和，我们生成了一个克隆的293T靶细胞系，稳定表达LgBiT、SARS-CoV-2受体ACE2和Spike激活蛋白酶TMPRSS2。SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLP进入这些靶细胞预计最终导致NanoBiT荧光素酶互补和发光。确实，将SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs添加到靶细胞中导致发光信号从0到2小时迅速增加，并在3到4小时达到平台期。HiBiT-PsVLP进入是Spike依赖性的，因为Bald HiBiT-VLPs产生的发光与单独的靶细胞相似。SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLP进入是ACE2依赖性的，并且通过TMPRSS2表达增强。相反，TMPRSS2抑制剂camostat mesylate减少了SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLP进入ACE2⁺/TMPRSS2⁺靶细胞，但对带有水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）假型化的HiBiT-PsVLPs的进入没有影响。总的来说，这些结果证明了使用HiBiT-PsVLP系统快速发光检测SARS-CoV-2 Spike介导的细胞进入。

抗Spike NMAbs对SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的中和作用

首先使用新鲜培养的靶细胞和抗Spike NMAb bamlanivimab的生物类似物评估了SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的抗体中和作用。鉴于在图2b中观察到的进入动力学，选择了3小时的中和测定终点。Bamlanivimab生物类似物以浓度依赖性方式降低测定发光，在测试的最高浓度下完全中和SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs。使用冷冻保存的即融即用靶细胞获得了类似的结果，这些细胞表达的ACE2和TMPRSS2水平与新鲜培养的细胞相当。即融即用细胞（通常称为即用型或测定就绪细胞）相对于连续细胞培养具有明显优势，包括更高的测定重现性、成本/时间节省以及安排测定的灵活性。因此，在本研究的剩余部分中，中和测定均使用即融即用靶细胞。

使用从恢复期患者中先前分离的抗Spike mAb克隆评估了SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLP中和的特异性。我们选择了约1–2 × 10⁵ RLUs/孔的HiBiT-PsVLP输入量，该输入量产生>5倍的信号背景比，并落在稳健的中和操作范围内。该输入量用于所有后续的中和实验。NMAb克隆414-1中和了SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs，而非中和性抗Spike克隆415-6没有效果。靶向埃博拉病毒糖蛋白（EBOV GP）的NMAb KZ52也未能中和SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs，进一步证明了对抗Spike NMAbs的特异性。

为了评估与早期NMAb发现工作流程的兼容性，我们比较了96孔板和384孔板格式的测定性能。原始发光值在384孔格式中降低，正如给定减少的测定体积所预期的那样。尽管如此，HiBiT-PsVLP中和在两种格式之间密切一致，证实该测定可以小型化用于高通量工作流程。

在NMAb发现过程中，候选NMAbs通常在哺乳动物细胞中表达，并且含有mAb的上清液被筛选中和活性。为了模拟这种方法，我们生成了带有抗Spike NMAb imdevimab（IMD-huIgG1）或抗EBOV GP NMAb mAb114（mAb114-huIgG1）可变区的人IgG1表达构建体。来自用这些构建体转染的细胞的上清液被测定用于SARS-CoV-2 S和EBOV GP HiBiT-PsVLPs的中和。来自表达IMD-huIgG1的细胞的上清液中和了SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs，但不中和EBOV GP HiBiT-PsVLPs。相反，来自表达mAb114-huIgG1的细胞的上清液中和了EBOV GP HiBiT-PsVLPs，但不中和SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs。这些结果证实了通过上清液中瞬时表达的NMAbs对HiBiT-PsVLPs的病毒糖蛋白特异性中和。

SARS-CoV-2 HiBiT-PsVLP生物测定的资质认定

SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLP中和生物测定根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2(R2)指南进行了资质认定。结果总结在表1和图4中。测定特异性在图3d中得到确认。该测定在50%至200%相对效价范围内是线性的（R² = 0.996）。图4b显示了来自代表性测定的剂量反应曲线，比较了50%、70%、100%、150%和200%相对效价下的NMAb样品。重复性（n = 6）为3.9%。中间精密度为11.2%。不同相对效价下的测定准确度范围从96.8%到105.6%。

使用热应激的NMAb样品测试了测定的稳定性指示特性。该测定检测到相对于在4°C下保持的未应激样品，随着在65°C下孵育时间的增加，NMAb效价损失。在65°C下孵育24或48小时的样品，相对效价分别降低了约83%和约91%，证实该测定是稳定性指示的。 together，这些结果表明，该生物测定的分析性能适用于按照良好生产规范（GMP）对NMAbs进行质量检验。

与替代病毒中和试验的基准比较

sVNTs是一种 established 方法，通常用于评估抗体中和，而无需病毒或假病毒。与HiBiT-PsVLPs类似，sVNTs在很大程度上减轻了生物安全问题，并提供了NMAb活性的快速定量测量。鉴于这些相似之处，我们试图使用一组抗Spike mAbs将SARS-CoV-2 HiBiT-PsVLP生物测定与市售的sVNT进行比较。非中和性抗Spike克隆415-6被用作两种测定的阴性对照，并且在两种测试中均显示最小的活性。相反，靶向Spike RBD的NMAbs在两种测定中均表现出浓度依赖性的中和活性，产生具有R²值≥0.95的S形、4参数逻辑剂量反应曲线。中和效价，表示为半数最大抑制浓度（IC₅₀值），为每个这些NMAbs确定并在测定之间进行比较。在HiBiT-PsVLP生物测定和sVNT之间观察到强正相关（Pearson r = 0.79）。

值得注意的是，靶向Spike N末端域（NTD）的NMAb克隆4A8仅在HiBiT-PsVLP生物测定中表现出中和活性。这一结果是预期的，因为sVNT仅包括纯化的Spike RBD，而HiBiT-PsVLPs掺入了Spike的完整胞外域和跨膜区。因此，虽然对于RBD特异性NMAbs与sVNT高度相关，但HiBiT-PsVLP生物测定提供了更广泛的表位覆盖和更多样化MoAs的检测。

用于抗HIV NMAb开发的HiBiT-PsVLPs

鉴于假型化的固有灵活性，我们预测HiBiT-PsVLP平台可以适用于其他临床相关病毒。尽管自2004年高峰以来HIV相关死亡人数急剧下降，但每年仍有超过500,000例此类死亡发生。因此，仍然需要新的和改进的针对HIV的对策，包括能够减少病毒传播的NMAbs和其他预防剂。

HIV-1中和通常使用TZM-bl测定进行评估，这是一种专门的PNA，涉及假病毒编码的HIV Tat蛋白对细胞报告基因的反式激活。尽管该测定与复制 competent 的HIV-1相比提供了改进的生物安全性，但它仍然需要多天才能读出结果。因此，我们推断HiBiT-PsVLPs可以提供一种更快的方法来检测HIV-1中和。为了测试这一预测，我们首先生产了一个293T靶细胞系，稳定表达LgBiT以及HIV-1受体CD4和共受体CCR5和CXCR4。我们接下来生成了带有来自两种不同CCR5嗜性分离株BaL和JRFL以及一种CXCR4嗜性菌株NL4-3的HIV-1包膜（Env）蛋白的HiBiT-PsVLPs。每个HIV Env蛋白的内域被截短以改善假型化。将HIV Env HiBiT-PsVLPs添加到靶细胞中导致随时间增加的发光，在4至5小时观察到峰值进入。

对于中和研究，我们使用了带有来自JRFL分离株的Env蛋白的HiBiT-PsVLPs。该分离株表现出 tier 2 中和表型，被认为是大多数循环HIV-1毒株的典型代表。基于图6a的结果，选择了4小时的测定终点。HIV Env(JRFL) HiBiT-PsVLPs被VRC01中和，而非特异性对照抗体对进入没有影响。这些数据证明了使用HiBiT-PsVLPs以相对于TZM-bl测定 dramatically 缩短的周转时间来探究HIV-1中和的可行性。

用于新发病毒病原体的HiBiT-PsVLPs

世界卫生组织和流行病防范创新联盟已经确定了关键新发病毒 panel，以指导全球大流行防范工作。这些优先病原体是根据其流行和大流行潜力、高发病率和死亡率以及缺乏针对它们的特定对策而选择的。由于这些病毒中的许多是风险组4病原体，我们预测HiBiT-PsVLP平台可以提供一种安全但生物学相关的替代方法来评估其中和。为了解决这一假设，我们首先生成了带有来自三种不同丝状病毒糖蛋白（GP）的HiBiT-PsVLPs：扎伊尔埃博拉病毒（EBOV）、苏丹埃博拉病毒（SEBOV）或马尔堡病毒（MARV），每种都会在人类中引起严重的出血热。尽管有用于EBOV的许可疫苗和NMAbs，但目前尚无针对MARV或SEBOV的特定对策。

使用表达LgBiT的293T细胞确认了丝状病毒GP HiBiT-PsVLPs的进入。丝状病毒GP介导的进入明显慢于由SARS-CoV-2 S或HIV Env驱动的进入，这与病毒进入途径的差异一致。虽然SARS-CoV-2 S和HIV Env可以在质膜处介导进入，但丝状病毒GPs需要运输到晚期内体和/或溶酶体，以与细胞内受体NPC-1结合并随后发生膜融合。这一额外的运输步骤可能延迟了HiBiT-PsVLP测定中发光的 onset。尽管如此，每种丝状病毒HiBiT-PsVLP都被靶向其GP的NMAb中和，证明了尽管存在途径依赖性的进入动力学差异，但具有特异性中和。

我们进一步将HiBiT-PsVLP平台扩展到另外两种优先病原体：拉沙病毒（LASV），一种引起急性出血性疾病的沙粒病毒；和尼帕病毒（NiV），一种引起急性呼吸道疾病和致命性脑炎的副粘病毒。选择表达LgBiT的293T细胞作为靶细胞系，因为它们内源性表达主要的LASV受体α-肌营养不良聚糖和NiV受体EphrinB2和EphrinB3。带有LASV糖蛋白复合物（GPC）的HiBiT-PsVLPs进入靶细胞，并被抗LASV GPC NMAb特异性中和。NiV HiBiT-PsVLPs使用病毒附着糖蛋白（G）和内域截短的病毒融合蛋白（F）生成。这些HiBiT-PsVLPs进入靶细胞，并被抗NiV F NMAb中和。 together，这些研究证明了HiBiT-PsVLP平台的灵活性及其在促进针对各种新发病毒病原体的NMAb开发方面的潜力。

使用HiBiT-PsVLPs测量抗体依赖性增强

ADE测定通常依赖于活病毒或假病毒，并且受到与传统中和测定相同的许多缺陷的影响。因此，我们试图确定HiBiT-PsVLPs是否可以提供一种安全快速的替代方法来测量ADE。为此，我们将LgBiT表达工程化到THP-1人单核细胞中，这些细胞内源性表达FcγRI和FcγRIIa。然后，我们在存在不同mAbs的情况下，测定了EBOV GP HiBiT-PsVLP进入该靶细胞系的情况。EBOV GP HiBiT-PsVLP进入被cosfroviximab增强了约七倍，这是一种非中和性抗EBOV-GP mAb，先前被证明在体外诱导ADE。缺乏EBOV GP特异性的同型匹配对照mAb对HiBiT-PsVLP进入没有影响。与cosfroviximab相反，抗EBOV-GP NMAb KZ52产生了双相反应，在低浓度下增强进入，并在较高浓度下中和HiBiT-PsVLPs。KZ52的Fc域是增强所必需的，但对于中和是可有可无的，这与先前的报告一致。

为了确认FcγRs的作用，我们生成了THP-1/HaloTag-LgBiT CRISPR敲除系，缺乏FcγRI、FcγRII或两种受体。通过敲除FcγRI，cosfroviximab和KZ52的ADE减少或消除，而FcγRII敲除对ADE没有显著影响。KZ52的中和活性在不同的敲除系中得以保留。 together，这些结果与检测到经典的、FcγR相关的ADE一致，该ADE主要由mAb Fc与FcγRI的相互作用驱动。

讨论

NMAbs在抗病毒防御中发挥着独特作用，强效且理想地具有广泛作用的NMAbs可作为治疗和预防剂。 robust 的、反映MoA的中和测定对于识别最有前途的NMAbs并引导这些候选物通过开发管道至关重要。在本研究中，我们将HiBiT-PsVLP系统建立为一个安全、快速和 versatile 的生物测定平台，其应用跨越NMAb开发的多个阶段。该平台与标准发现工作流程兼容，能够快速表征NMAb效价和稳定性，并展示适用于质量放行测试的性能特征。此外，该系统可以适用于测量ADE，从而在NMAb开发的早期阶段识别潜在的安全问题。

替代中和测定提供了比活病毒中和试验更安全、更高通量和更快的替代方案，因此更适合许多研究和GMP环境。尽管如此，每种替代测定都具有独特的优势和局限性。基于ELISA的方法（例如sVNTs）快速且安全，但无法捕获病毒进入的全部复杂性，通常仅测量病毒RBD与其同源受体之间的相互作用。相反，假病毒掺入了病毒糖蛋白的完整胞外域并重现了天然病毒进入，因此提供了比sVNTs更大的生物学相关性。然而，PNAs dramatically 比sVNTs慢，测定时间通常为1至4天。相比之下，HiBiT-PsVLPs提供了与传统PNAs相同的好处，且测定时间接近sVNTs。HiBiT-PsVLPs的生物安全性也比基于HIV的假病毒有所改进，因为HiBiT-PsVLPs缺乏HIV pol基因编码的酶，并且不依赖于病毒核酸的包装。这些变化减轻了插入突变和重组形成复制 competent 病毒的风险。尽管我们的研究将HiBiT-PsVLPs与商业sVNT进行了基准测试以提供标准化参考，但未来的工作应包括与PNAs和活病毒测定的直接比较，以更清楚地定义HiBiT-PsVLPs如何与 established 方法保持一致。

与传统的PNAs不同，HiBiT-PsVLP生物测定需要使用表达LgBiT的靶细胞进行互补性读出。对于许多广泛使用的“主力”细胞系，例如本研究中使用的HEK293T细胞，可以通过稳定质粒转染轻松引入LgBiT表达。对于更专业的模型（例如原代细胞培养），可能需要替代的基因递送方法，例如LgBiT mRNA转染或病毒转导。在每种情况下，LgBiT基因递送所需的时间将至少部分地被HiBiT-PsVLP生物测定相对于PNAs缩短的周转时间所抵消。此外，与假病毒不同，HiBiT-PsVLPs不通过报告基因表达提供 intrinsic 信号放大，导致较低的信噪比。尽管如此，如本研究所示，发光和信噪比足以定量评估中和和ADE。

像假病毒一样，HiBiT-PsVLPs可以通过交换其表面的糖蛋白来快速适应不同的病毒病原体。在我们的研究中，SARS-CoV-2 S HiBiT-PsVLPs的HiBiT:p24比率相对于Bald对照升高。由于每个Gag分子携带一个HiBiT标签，这种增加不太可能反映每个Gag蛋白的HiBiT化学计量变化，而是可能源于颗粒组成或检测效率的差异。重要的是，升高的比率在独立制备中相似，支持了HiBiT掺入的重现性。除了SARS-CoV-2和HIV，我们预计HiBiT-PsVLP平台可以应用于其他具有全球公共卫生关注的地方性病毒。如此处所示，HiBiT-PsVLPs也可以适用于许多具有流行/大流行潜力的优先病毒，突出了该平台对于大流行防范的效用。HiBiT-PsVLPs也可以用于病毒糖蛋白的诱变研究，以识别改变NMAb敏感性的突变。类似地，这些测定可用于发现和开发旨在减少突变逃逸可能性的NMAb cocktail。

与PNAs一样，当前的HiBiT-PsVLP平台仅限于包膜病毒。此外，来自某些包膜病毒（如登革热病毒）的糖蛋白难以掺入异源病毒颗粒中，并且可能同样证明与我们的基于HIV-1 Gag的系统不兼容。在这种情况下，HiBiT标签可以附加到来自相同病毒或相关家族成员的结构蛋白上，以生成能够掺入这些糖蛋白的HiBiT标记VLPs。HiBiT-VLP方法最近也通过将HiBiT标签融合到VLP组装所需的结构蛋白上扩展到非包膜病毒。

尽管本研究主要关注NMAb开发的应用，但我们预计HiBiT-PsVLP生物测定可以用于其他抗病毒方式。NAb滴度被认为是针对许多病毒的保护相关因素，并且最近描述了类似的HiBiT标记VLP方法用于筛选针对SARS-CoV-2的疫苗接种后血清。相比之下，我们的HiBiT-PsVLP系统省略了HIV-1 pol基因以提高生物安全性，并采用了简化的、同质的工作流程，非常适合高通量筛选。我们平台经过验证的灵活性及其评估ADE的能力为疫苗研究提供了额外优势。HiBiT-PsVLP生物测定也有助于开发针对病毒糖蛋白或必需宿主因子的小分子进入抑制剂。

除了抗病毒药物开发，我们预见了HiBiT-PsVLP技术在基础病毒学研究中的关键应用。在我们的测定中，发光动力学通常以与已知进入途径一致的方式变化——例如，对于在质膜融合的病毒，信号出现得更快，而对于需要内吞作用和细胞内运输的病毒则较慢。这种途径依赖性的差异表明，HiBiT-PsVLPs可以提供一个生物学相关的系统，以类似于传统假病毒的方式探究进入机制（例如，受体使用、内吞依赖性、pH敏感性）。鉴于其非复制性质，HiBiT-PsVLPs也可以作为一个安全平台，用于筛选改变受体使用和宿主范围的糖蛋白突变，而没有许多与复制 competent 系统相关的功能获得担忧。