VP5区双氨基酸突变介导人轮状病毒疫苗减毒：来自体外与体内研究的证据

本综述系统阐述了利用反向遗传学技术鉴定人轮状病毒疫苗株CDC-9（G1P[8]）减毒的关键分子机制。研究首次证实VP4基因VP5*区域的两个特异性氨基酸突变（AA331和AA385）是介导病毒体外复制适应性增强和体内致病性减弱的决定性因素，为替代传统细胞传代减毒、开发更安全高效的靶向突变轮状病毒疫苗提供了关键科学依据。

　　

ABSTRACT

多种疫苗如脊髓灰质炎、麻疹和轮状病毒疫苗通过细胞培养中的连续传代得以开发。口服轮状病毒减毒活疫苗已被证明总体安全，但其减毒机制尚不明确。本研究利用新型全质粒反向遗传学系统，人工生成人轮状病毒疫苗株CDC-9（G1P[8]），并分析VP4基因突变对体外适应和体内减毒的影响。结果表明，在Vero细胞连续传代后出现的6个氨基酸突变中，野生型CDC-9 P11在VP4 AA331和AA385处的单点或组合突变与体外复制增强相关，达到与细胞培养适应株CDC-9 P45相当的水平。感染AA331或AA385单点突变体的新生大鼠病毒脱落减少，与传代CDC-9 P45相当。在感染携带AA331_385_388组合突变体的新生大鼠中观察到脱落进一步减少，表明略有叠加效应。数据表明，VP4基因VP5*区域的突变，特别是AA331和AA385位点，是G1P[8]轮状病毒疫苗体外复制适应和体内减毒的决定性因素。该信息为轮状病毒疫苗生成中采用靶向突变替代耗时费力的细胞连续传代提供了巨大潜力。

IMPORTANCE

口服轮状病毒减毒活疫苗通过细胞培养连续传代开发，并在儿童中证明安全有效。但活疫苗也与接种儿童中罕见但严重的 adverse events（如肠套叠）相关。疫苗减毒和 adverse effects 的机制未知。我们开发了新型人轮状病毒疫苗株（CDC-9），并证明了细胞传代病毒VP4基因中的若干氨基酸突变。本研究通过反向遗传学技术鉴定了VP4中的两个关键氨基酸突变，它们介导了在细胞培养（包括人肠道细胞系）中的增强生长、新生大鼠中病毒脱落的减少以及炎症反应的下调。该研究首次鉴定了定义人轮状病毒疫苗减毒的分子特征，应为开发新一代安全有效疫苗提供指导。

INTRODUCTION

细胞培养中的连续传代已被用于生成减毒病毒株，用于麻疹、脊髓灰质炎、腮腺炎、风疹、水痘和轮状病毒疫苗开发。基因组内的序列变化可与病毒在组织培养中的适应和体内减毒相关联，使连续传代成为生成减毒活疫苗株的重要工具。多种已上市的轮状病毒疫苗，包括人轮状病毒疫苗Rotarix（G1P[8]）和Rotavac（G9P[11]），均通过野生型轮状病毒分离株在细胞培养中的连续传代开发，在儿童中证明减毒且免疫原性良好，并已在超过120个国家纳入常规免疫。然而，轮状病毒感染仍是全球5岁以下儿童严重胃肠炎的首要原因，每年导致约128,000例死亡。口服轮状病毒减毒活疫苗总体安全，但与罕见但严重的 adverse event（肠套叠）相关，需要持续监测。因此，理解轮状病毒减毒的遗传基础对于开发具有改进安全性的新疫苗至关重要。Rotarix祖先株89-12（G1P[8]）在非洲绿猴肾（AGMK）原代细胞中传代26次，随后在Vero细胞系中传代7次。减毒Rotarix和祖先株89-12的序列分析揭示了VP4中总共5个氨基酸（AA）突变。婴儿接种Rotarix导致与亲本89-12株感染相比脱落减少且无腹泻。尽管有压倒性的安全性和有效性数据，这些疫苗减毒和安全的遗传基础及机制仍然未知。

轮状病毒属于Sedoreoviridae家族，是一种无包膜的双链RNA（dsRNA）病毒。基因组由11个节段组成，编码6种结构蛋白（VP1-VP4, VP6-VP7）和6种非结构蛋白（NSP1-NSP6）。三层 infectious 轮状病毒颗粒的外层由结构蛋白VP7和VP4组成。VP4负责细胞附着和进入，并被蛋白酶切割成两个功能亚基VP8和VP5以进行感染。尽管其表位可变，多项研究调查了VP8亚单位疫苗在预防儿童轮状病毒感染中的功能。相比之下，VP5在人毒株间序列更保守，对轮状病毒感染时的细胞膜透化和细胞进入至关重要，并将在本研究分析以理解其对细胞生长适应和动物减毒的影响。

我们开发了新型人轮状病毒疫苗株CDC-9（G1P[8]），用于减毒活或灭活人轮状病毒疫苗接种。CDC-9从美国一名感染儿童的粪便标本中分离，在MA104细胞中连续传代7次（P7），随后在Vero细胞中传代38次，总共45次（P45）。CDC-9 P7也在MA104细胞中额外传代5次，总共12次（P12），用于本研究。由于从粪便到MA104细胞传代12次没有氨基酸序列变化，CDC-9 P12被视为野生型病毒。在Vero细胞中连续传代至第28代（P28）期间，我们观察到与粪便和仅在MA104中传代的CDC-9 P11/12相比，VP4中有5个AA变化，VP6、NSP1和NSP5中各有一个变化。当我们将CDC-9连续传代至P45时，我们注意到VP1中有一个AA变化，VP2中有10个AA缺失，以及VP4 AA499处一个额外的AA突变。我们证明CDC-9 P45和CDC-9 P28在各种细胞系中生长至更高滴度，并与新生大鼠中相比CDC-9 P11/12感染脱落减少相关，表明确实，CDC-9的连续传代导致了适应和减毒。有趣的是，CDC-9 P28和CDC-9 P45在体外复制达到可比的高滴度，与P28和P45之间发生的VP2缺失无关。这表明VP4突变是连续传代过程中细胞培养适应的驱动因素。在CDC-9 VP4中观察到的六个氨基酸突变中，没有一个发生在VP8，四个发生在VP5的膜融合域，表明VP5*中的突变可能是CDC-9减毒和适应的原因。

最近的研究使用全质粒反向遗传学系统生成重配轮状病毒株，其携带猿猴（SA11）骨架上的VP4基因。这些研究为P[4]和P[8]临床分离株的生长以及更好理解人轮状病毒株在细胞培养中的适应铺平了道路。然而，至今尚无研究鉴定轮状病毒基因内特定位置的特定AA序列负责人轮状病毒疫苗株的适应和减毒。在本研究中，我们利用完整的传代历史和完全阐明的核苷酸及氨基酸序列，通过反向遗传学技术检查VP5*中特定突变与记录的人轮状病毒疫苗株CDC-9体外和体内表型之间的关联。本研究结果将有助于加速开发，跳过耗时的细胞培养连续传代过程，并提高轮状病毒疫苗的安全性。

RESULTS

轮状病毒VP4对体外感染性和体内毒力的重要性

轮状病毒VP4蛋白对细胞附着、细胞壁穿透和进入细胞质至关重要。为理解VP4对感染性和致病性的影响，我们在CDC-9 P11背景上生成了重组单重配株，其携带来自猿猴（SA11）、牛（UK）和人（CDC-9）轮状病毒的不同VP4基因。野生型CDC-9 P11与减毒CDC-9 P45仅VP4基因的重组单重配（rCDC-9 P11 VP4_P45）在MA104细胞中的滴度与rCDC-9 P11相比显著增加，表明CDC-9 P45中的VP4主要负责该株增强的细胞培养复制能力。有趣的是，携带猿猴（RRV或SA11）或牛（UK）VP4的单重配株滴度仍低于rCDC-9 P11 VP4_P45，最可能由于CDC-9 P45 VP4的减毒性质。为确定VP4来源对体内感染性和致病性的影响，我们最初用1×10⁷ FFU的恒河猴轮状病毒（RRV）、rCDC-9 P11、携带RRV VP4的rCDC-9 P11（rCDC-9 P11 VP4_RRV）、携带P45 VP4的rCDC-9 P11（rCDC-9 P11 VP4_P45）或模拟对照感染5日龄新生大鼠。病毒感染后新生大鼠的体重反映了这些动物的总体状态和健康。我们观察到感染rCDC-9 P11 VP4_P45和模拟对照的动物体重增加相当，但感染RRV、rCDC-9 P11 VP4_RRV和rCDC-9 P11的动物体重增加减少。值得注意的是，任何感染动物均未观察到腹泻。我们观察到感染RRV的动物轮状病毒脱落水平最高，其次是第4天的rCDC-9 P11 VP4_RRV。rCDC-9 P11感染的大鼠有中等水平脱落，但感染rCDC-9 P11 VP4_P45后轮状病毒脱落显著减少。这些结果表明减毒疫苗株CDC-9 P45的VP4基因介导新生大鼠中脱落减少和细胞培养中病毒生长增加，并证明该疫苗株因VP4基因内的序列变化而体外适应和体内减毒。

生成带有VP4基因突变的重组CDC-9株

通过创建在CDC-9 P11背景上携带CDC-9 P45 VP4的重组病毒，我们证明了VP4突变对体内减毒和体外适应的重要性。在Vero细胞连续传代期间，我们观察到VP4内总共六个功能性AA突变。为鉴定轮状病毒候选疫苗株CDC-9的VP4基因中哪个突变负责体外生长适应和体内减毒，我们生成了多个在VP4基因中带有单点或多点突变的重组轮状病毒株。VP4的结构视图表明6个现存突变中有5个位于VP4的VP5区域，而仅一个突变在VP4的VP8区域。我们通过反向遗传学成功生成了CDC-9 P11（rCDC-9 P11）和CDC-9 P45（rCDC-9 P45）、P11背景上VP4中的单点突变（rCDC-9 P11 VP4_AA51、rCDC-9 P11 VP4_AA331、rCDC-9 P11 VP4_AA385和rCDC-9 P11 VP4_AA499）以及P11背景上VP4中的多点突变（rCDC-9 P11 VP4_385_388、rCDC-9 P11 VP4_AA331_385_388和rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388），并在MA104细胞第4代测定其滴度。我们观察到rCDC-9 P45、rCDC-9 P11 VP4_AA385_388、rCDC-9 P11 VP4_AA331_385_388和rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388与rCDC-9 P11相比有显著滴度差异。值得注意的是，rCDC-9 P11 VP4_AA51和rCDC-9 P11 VP4_AA499显示比rCDC-9 P45更低的滴度，但与rCDC-9 P11滴度相当。我们未能生成AA364和AA388的单点突变体。所有生成的重组CDC-9株的序列和突变通过下一代测序确认。

重组CDC-9株的体外比较

在先前研究中，我们显示天然CDC-9 P45在人肠道细胞系（Caco-2）中比CDC-9 P11生长至更高滴度。此处，我们使用重组CDC-9株和VP4突变株以确定这些重组株生长是否存在差异。如原始CDC-9 P11和CDC-9 P45株所见，我们显示重组CDC-9 P11（rCDC-9 P11）在Caco-2细胞84小时时间过程中与rCDC-9 P45相比生长至显著更低滴度。带有AA331或AA385位点单点突变的重组病毒能够复制至rCDC-9 P45所见滴度，表明这两个突变主要负责CDC-9株的体外适应。带有51或499位点单点突变的重组病毒在Caco-2细胞中显示与rCDC-9 P11可比生长，表明这两个突变在细胞培养适应中不起作用。值得注意的是，感染携带385和388位点双突变的重组病毒（rCDC-9 P11 VP4_AA385_388）并未显示比单独rCDC-9 P11 VP4_AA385显著增加滴度。感染rCDC-9 P11 VP4_AA331_385_388和rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388显示对复制略有叠加效应。除感染性滴度外，我们检查了原始CDC-9 P11及其VP4突变体感染斑块的大小。我们观察到感染天然CDC-9 P45及其突变体rCDC-9 P11 VP4_AA331和rCDC-9 P11 VP4_AA385后在MA104细胞中有清晰的大斑块。相比之下，CDC-9 P11未观察到任何斑块。这些数据表明AA331和AA385位点的突变对最佳体外适应和生长至关重要。

鉴定参与CDC-9在新生大鼠中减毒和致病性的分子特征

由于我们先前观察到CDC-9 P45 VP4对体重增加无影响但显著减少病毒脱落，我们接下来使用新生大鼠模型评估这些VP4突变中哪些对CDC-9株体内减毒重要。感染rCDC-9 P11导致从第6天到13天与感染rCDC-9 P45和模拟接种动物相比体重增加显著减少。感染rCDC_9 P11 VP4_AA331和rCDC-9 P11 VP4_AA385显示正常体重增加，与rCDC-9 P45和模拟对照相当。组合突变体rCDC-9 P11 VP4_AA331_385_388和rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388也显示比rCDC-9 P11显著更大的体重增加。

为识别VP4及其突变体对疾病进展和轮状病毒脱落的影响，我们测量了新生大鼠14天内的轮状病毒脱落。rCDC-9 P11诱导高水平脱落，峰值脱落介于第4和第5天之间。rCDC-9 P11进一步在10只动物中的4只接种后2-3天诱导腹泻，感染其他重组病毒的新生大鼠未观察到腹泻。感染rCDC-9 P45诱导与rCDC-9 P11相比显著更少脱落，峰值脱落从第4天到第6天。感染rCDC-9 P11 VP4_AA331或rCDC-9 P11 VP4_AA385的动物可见类似模式，与rCDC-9 P11相比脱落显著减少。然而，感染rCDC-9 P11 VP4_AA385的动物峰值脱落从第3天持续到第7天，而感染rCDC_9 P11 VP4_AA331后峰值脱落较短，介于第4和第6天之间。与体外数据类似，51和499位点突变似乎未显著改变与rCDC-9 P11相比病毒的毒力。我们观察到感染rCDC-9 P11 VP4_AA51或rCDC-9 P11 VP4_AA499和rCDC-9 P11的动物脱落水平升高，峰值在第4和第5天。

为检查VP4中多点突变是否有叠加效应，用携带VP4中两个、三个或四个突变的重组CDC-9感染大鼠。rCDC-9 P11双VP4突变体AA385和AA388诱导的脱落水平与单突变体AA385相当。rCDC-9 P11三VP4突变体AA331、AA385和AA388和四突变体AA331、AA364、AA385和AA388诱导可比脱落水平，峰值在第4或5天，似乎略低于双突变体。这些结果表明VP4 AA331和AA385的双点突变对该G1P[8]轮状病毒的减毒水平有叠加效应，而VP4 AA388位点突变似乎对其进一步减毒有微小附加效应。AA364位点的额外突变（rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388）并未显着进一步减少脱落。

感染重组CDC-9株和突变体后的细胞因子反应

细胞因子和趋化因子在疾病进展和轮状病毒脱落中起关键作用。我们分析了感染不同重组轮状病毒后新生动物的细胞因子和趋化因子谱。我们显示与rCDC-9 P11相比，感染rCDC-9 P45后抗炎细胞因子白细胞介素（IL）-10和免疫调节粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）显著上调。此外，我们观察到感染rCDC-9 P11 VP4_AA331_385_388和rCDC-9 P11 VP4_AA331_364_385_388后GM-CSF显著上调。我们还观察到与感染rCDC-9 P11 VP4_AA385的大鼠相比，rCDC-9 P11 VP4_AA331感染动物中IL-10显著增加。另一方面，与rCDC-9 P45相比，感染rCDC-9 P11后促炎细胞因子IL-1β、IL-7、IL-18和趋化因子MCP-1和MIP-1α上调。我们显示感染rCDC-9 P45导致与感染rCDC-9 P11相比促炎细胞因子IL-2表达减少和IL-12表达显著减少。我们显示rCDC-9 P11 VP4_AA385诱导与rCDC-9 P11可比的IL-1β、IL-18、MCP-1和MIP-1α水平，表明该突变不参与调节这些体内细胞因子。值得注意的是，任何测试的VP4突变体均未发现II型干扰素表达的显著差异。

DISCUSSION

在本研究中，我们全面分析了人疫苗株CDC-9在Vero细胞中连续传代期间发生的轮状病毒VP4基因内突变，并首次鉴定了VP5膜融合域中两个促进体外适应和体内减毒的分子特征。先前研究显示，当检查携带人或鼠VP4在猿猴轮状病毒骨架上的异源重组轮状病毒株时，VP4是促进细胞培养中复制的关键因素。我们还显示，用人VP4（RRV）在人类背景（rCDC-9 P11）上感染新生大鼠导致与亲本人rCDC-9 P11轮状病毒感染相比新生大鼠中显著更高脱落。此外，当使用rCDC-9 P11（野生型）背景与CDC-9 P45（减毒）的VP4时，我们能够重现用完全重组和细胞培养衍生的减毒CDC-9 P45观察到的发现。我们进一步显示rCDC-9 P11 VP4_P45和rCDC-9 P45在猿猴（MA104）和人（Caco-2）细胞系中生长至显著更高滴度，与rCDC-9 P11相比。这些数据支持我们实验室先前发表的研究，即原始、细胞培养适应的CDC-9 P45比CDC-9 P11生长至显著更高滴度。我们的发现证明了VP4在适应细胞培养高生长中的主要重要性，尽管其他轮状病毒基因中有一些突变发生。一项早期研究检查了NSP4基因内突变对人轮状病毒疫苗Rotarix减毒的影响，但未鉴定出相关性。

先前研究分析了整个VP4基因替换的效果，并未通过反向遗传学鉴定VP4内的特定突变。当分析循环或传代株中VP4的突变时，大多数突变出现在VP5区域，特别是在AA360和AA400之间。VP4的AA382-400区域被定义为VP5中的膜相互作用环，其融合域在AA385。该区域的替换可能有利于细胞培养中的生长优势并使病毒在人类中减毒。疫苗株Rotarix中VP4内出现五个突变，即G51D、L167F、S331F、D385Y和N695I。51、331和385位点的突变在Rotarix和CDC-9细胞培养连续传代后发现保守。轮状病毒进入高度依赖于VP5中的融合域（AA384–AA404），该区域内AA变化可导致VP4构象变化。AA385位点被其他几项研究鉴定为人类轮状病毒连续传代后的突变，而385D的高度保守在野生型P[8]轮状病毒中报道，不在细胞培养传代株中。然而，这些发现仅鉴定该一位点AA突变与株适应和减毒之间的关联。

尽管如此，这些已发表的具有AA385单点突变的数据与本研究中介导细胞培养中复制能力增加和新生大鼠中感染性减少一致。我们进一步观察到AA331和AA385双点突变对减毒的叠加效应，这与这些两个突变在第13代（MA104细胞中7代和Vero细胞中6代）当株适应在Vero细胞中生长时一起出现的数据一致。此外，我们观察到在第26和43代（Vero细胞中19和36代）分别出现的AA388和AA499位点突变。Vero细胞适应病毒中突变的出现可直接与增加滴度（P25时约10⁷ FFU/mL）相比MA104传代CDC-9 P11（滴度约10⁵ FFU/mL）相关联。感染性滴度在这些晚期突变出现后未进一步增加，因为滴度在第26和45代之间从1.3×10⁷ FFU/mL到4.5×10⁷ FFU/mL不等。我们证明了细胞培养传代与病毒毒力之间的负相关；CDC-9 P11在动物中诱导高水平病毒脱落和腹泻，而CDC-9 P45感染动物有显著减少的病毒脱落且无腹泻，证实了先前研究的发现。

我们未能生成带有AA364和AA388位点单点突变的重组CDC-9株。由于这些突变在初始AA变化在51、331和385位点第13代后出现，我们推测VP4蛋白内可能存在结构变化，诱导AA364和AA388的额外突变以产生稳定的VP4蛋白。对于CDC-9 P45，我们观察到与来自CDC-9 P11的VP4相比，VP4蛋白以直立构象出现。VP4直立构象的出现主要通过AA331、AA385和AA388的突变稳定VP4尖峰的顶端来解释。这些数据与最近发表的一项研究一致，该研究比较了各种轮状病毒基因型中的AA突变，并显示突变在AA380和AA390之间积累。该研究中分析的轮状病毒基因型G1P[8]、G3P[8]、G9P[8]、G12P[8]和G2P[4]未见AA331区域突变。然而，该研究通过在原代RhMK细胞中传代轮状病毒基因型（最多5代）随后在MA104细胞中传代（最多10代）完成，而我们看到在适应和传代于Vero细胞（疫苗制造常用细胞底物）后突变积累。我们显示突变AA385和AA388无叠加效应；然而，一旦我们引入AA331和AA364，我们能够看到体外（Caco-2细胞）可比滴度以及新生大鼠中正常体重增加和减少脱落。

细胞因子是靶向和帮助清除病毒感染的重要工具。感染不同轮状病毒后已报道各种细胞因子。促炎细胞因子和趋化因子如IL-1β、IL-8、GRO-α、RANTES、MIP-1α、MCP-1和IFN-γ已在细胞培养上清液以及人类感染后的血浆和粘膜表面检测到。我们在感染rCDC-9 P11后的新生大鼠中检测到促炎细胞因子和趋化因子（例如IL-1β和MIP-1α）的诱导，以及感染减毒rCDC-9 P45或携带AA331突变的VP4突变体（单点或组合）后向抗炎细胞因子（例如IL-10）的转变。这些数据突出了AA331突变与减少病毒脱落以及下调炎症反应的关联。值得注意的是，感染rCDC-9 P11 VP4_AA385并未下调所选细胞因子（例如IL-1β、IL-18 MIP-1α）的促炎反应，表明AA385可能参与减少体内病毒脱落但未调节如rCDC-9 P11 VP4_AA331所见的炎症反应。进一步研究需要调查AA385和其他突变对体内宿主反应的影响以完全理解减毒轮状病毒疫苗的免疫学特性。本研究检查了感染后21天动物血清中的细胞因子谱。由于可用新生大鼠数量有限，未进行早期时间点的细胞因子分析，应在未来研究中进行。

对于CDC-9，我们观察到位置331氨基酸性质的主要变化（S331F，亲水性到疏水性）和位置385从亲水性酸性到亲水性碱性氨基酸的变化（D385H），导致细胞培养（MA104和Caco-2）中生长增加和新生大鼠中致病性减少。在先前进行的研究分析CDC-9 P11和CDC-9 P45中VP4的蛋白质结构时，我们证明CDC-9 P45的VP5*域保持稳定直立位置，表明完全感染性病毒粒子，与CDC-9 P11相比，其不稳定且无法介导细胞进入。这些数据与CDC-9 P11以及rCDC-9 P11的较低体外感染性一致。在本研究期间，我们发现VP4中位置AA51、AA331或AA385的突变可能稳定VP4尖峰的尖端，因此导致三层CDC-9 P45颗粒的形成。与这些先前发现一致，我们来自带有AA331或AA385位点单点突变的rCDC-9 P11株的结果显示与rCDC-9 P11相比体外病毒生长显著增加和体内病毒脱落减少。相反，rCDC-9 P11 VP4_AA51未导致体外病毒生长增加或体内病毒脱落减少与rCDC-9 P11相比。因此，我们得出结论，AA331或AA385或两者的突变负责减毒和适应。当分析带有多点突变的重组变体时，我们证明位置AA331、AA385和AA388的突变组合似乎导致与减毒rCDC-9 P45可比的结果。由于AA331和AA385位点的突变在连续传代期间同时出现，并且两个突变体单独或组合诱导与rCDC-P45可比的体外和体内反应，仍需确定是否所有三个突变AA331、AA385和AA388需要一起工作以完全减毒CDC-9。我们显示rCDC-9 P11 VP4 AA331和rCDC-9 P11 VP4 AA385突变体与rCDC-9 P11感染动物中普遍的促炎状态相比主要诱导抗炎或抑制促炎反应。这种从针对野生型CDC-9 P11的促炎反应向针对晚期传代CDC-9 P45或VP4突变体的抗炎状态或减少促炎反应的转变可能解释脱落的 dramatically 减少及其在新生大鼠中的明显减毒。未来研究将进行以通过冷冻电子显微镜确定包含单点突变（rCDC-9 P11 VP4_AA331、rCDC-9 P11 VP4_AA385或rCDC-9 P11 VP4_AA388）和多点突变的VP4突变体的三维结构，并检查病毒-宿主相互作用以阐明突变和相关功能变化的机制。

总之，我们成功基于疫苗候选CDC-9野生型