猪血凝性脑脊髓炎病毒VW572株利用CD81受体及MVB来源外泌体通路在神经元细胞中实现高效侵入与传播

本研究揭示了猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）VW572株通过特异性利用四跨膜蛋白CD81受体和内体多泡体（MVB）来源的外泌体通路，在神经元细胞中实现高效病毒侵入和传播的新机制。与Gent/PS412和Labadie分离株相比，VW572株展现出独特的神经嗜性特征，为β冠状病毒（Betacoronavirus）的神经致病机制研究提供了重要模型，对理解SARS-CoV-2等病毒的神经系统并发症具有重要启示。

　　

ABSTRACT

猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV）是一种神经嗜性冠状病毒，可侵袭猪的外周（PNS）和中枢神经系统（CNS），引起急性脑脊髓炎，也称为“呕吐消瘦病”。近年来，PHEV被提议作为进一步阐明其他β冠状病毒神经致病机制的潜在替代病毒模型。本研究比较了三种不同PHEV分离株（VW572、Gent/PS412和Labadie）在小鼠神经母细胞瘤（N2a）细胞中复制周期的关键步骤。发现PHEV-VW572在这些细胞中的复制效率高于其他两种分离株。有趣的是，PHEV-VW572表现出高细胞内病毒滴度，但细胞外释放效率低。进一步研究表明，PHEV-VW572（而非PHEV-Gent/PS412）主要利用多泡体（MVB）来源的外泌体进行病毒排出。透射电子显微镜证实了细胞内囊泡中存在完整的PHEV-VW572病毒粒子，以及在质膜附近释放了融合的PHEV-外泌体结构。最后，研究表明所有分离株的结合均受限，但仅PHEV-VW572进入细胞是由四跨膜蛋白CD81受体介导的。这些结果表明，PHEV-VW572利用MVB来源的外泌体通路作为促进有效感染并克服神经元细胞中早期限制的策略。此外，这些发现突出了PHEV神经嗜性的分离株特异性差异。

INTRODUCTION

冠状病毒（CoVs）是人类和动物的常见病原体。虽然大多数引起轻度至重度呼吸道感染，但已知CoVs在多种宿主（包括啮齿类动物、猪和人类）中表现出神经嗜性和神经侵袭能力。自冠状病毒病（COVID-19）大流行以来，人们对β冠状病毒的致病机制及其对社会的影响日益关注。具体而言，全球多年来报道了众多与神经系统表现相关的COVID-19病例。然而，病毒在此类并发症中的确切作用尚不清楚。因此，迫切需要对β冠状病毒的神经致病潜力有更深入的了解。迄今为止，鼠肝炎病毒已被用作研究呼吸系统和神经系统表现病理生物学的实验平台，类似于人类CoVs。研究不足但同样相关的是，猪β冠状病毒——猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）最近被提议作为研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的替代模型。与SARS-CoV-2类似，PHEV可以通过嗅觉通路同样地侵袭小鼠的外周神经系统（PNS）并传播到中枢神经系统（CNS），从而引起神经炎症和神经系统症状，表明这两种病毒可能共享共同的病毒机制导致宿主的神经病理。

PHEV是一种具有兽医重要性的病原体，引起急性脑脊髓炎，也称为猪的“呕吐消瘦病”。该病毒在全世界大多数猪群中以亚临床形式高流行率传播。病毒主要通过密切接触和呼吸道飞沫传播，并通过口腔或鼻腔途径进入。潜伏期约为4至6天。它可以感染任何年龄的未接触过病毒的猪，但临床症状取决于年龄。出生于未接触过病毒的母猪并受到感染的新生仔猪死亡率达到100%。临床症状包括厌食，并在几小时内伴随或随后出现呕吐。感染后1天（dpi），鼻粘膜、扁桃体和肺作为主要复制部位。或者，病毒在口服接种后也可以在空肠绒毛的上皮细胞中复制。从2到3 dpi，PHEV传播到PNS。病毒通过支配主要复制部位的外周神经进展。可以使用多种病毒传播途径。第一种病毒传播途径是从鼻粘膜和扁桃体到三叉神经节。第二种途径是从肺到迷走神经。第三种途径是从小肠到太阳神经节。在4 dpi时，PHEV最终到达CNS（主要是脑桥和延髓）。大脑中的病毒复制和炎症导致死亡。迄今为止，尚无疫苗可用。

本研究通过比较三种不同PHEV分离株在小鼠神经母细胞瘤（N2a）细胞中的复制动力学，研究了PHEV的神经致病机制。旨在确定分离株之间复制周期中的关键相似性和/或差异，这些差异可能影响它们的神经嗜性和神经侵袭潜力。

RESULTS

PHEV-VW572感染N2a细胞，但细胞外病毒颗粒释放效率低

首先表征了三种PHEV分离株在N2a细胞中的复制动力学，以确定它们与完全易感的猪肾细胞（RPD）相比的神经侵袭潜力。如图1A所示，在接种后24小时（hpi），PHEV-VW572感染的RPD细胞百分比（约70%）显著高于PHEV-Gent/PS412和-Labadie分离株（约30%）。在48 hpi时，PHEV-VW572感染的RPD细胞百分比达到>80%，而PHEV-Gent/PS412和Labadie分离株分别约为60%和40%。相反，在24 hpi时，PHEV阳性的N2a细胞百分比仍然较低，并且在分离株之间相当（约10%）。虽然在48 hpi时，感染N2a细胞的百分比对于PHEV-VW572分离株增加到约70%，但对于PHEV-Gent/PS412和Labadie分离株没有显著增加（约10%–20%）。在72 hpi时，大多数接种PHEV-VW572的RPD细胞因感染而脱落。因此无法进行计数。尽管如此，Gent/PS412和Labadie感染的N2a细胞百分比在48至72 hpi之间保持相似。在较高感染复数（MOI）下，在感染PHEV-Gent/PS412和Labadie的N2a细胞中观察到感染的限速步骤，但对于PHEV-VW572分离株则没有。PHEV感染的代表性免疫荧光（IF）图片如图1B和D所示。在模拟条件下未检测到信号。PHEV S蛋白在RPD和N2a细胞的细胞质中表达，作为单个感染细胞和合胞体。

还量化了两种接种细胞类型中的细胞外和细胞内PHEV滴度以确认病毒感染性。如图1C所示，在24 hpi时，检测到所有分离株在RPD细胞中的细胞内和细胞外PHEV滴度增加。在48至72 hpi之间观察到最大滴度。注意到从72 hpi开始，PHEV细胞内滴度下降，因为大多数细胞在那个时候已经被感染。在N2a细胞中，从3 hpi开始检测到新复制的病毒，适用于PHEV-VW572和Gent/PS412分离株。细胞内病毒滴度在感染过程中对所有三种分离株增加，并达到与RPD细胞中观察到的水平相当的水平。相反，在N2a细胞中检测到的细胞外病毒滴度低于RPD细胞。虽然对于Gent/PS412和Labadie，PHEV细胞外滴度从24到72 hpi增加，但在整个感染过程中，对于神经元细胞中的PHEV-VW572未发现显著增加（<10³ 50%组织培养有效剂量[TCID₅₀]/mL）。此外，PHEV-VW572 N基因组RNA在细胞裂解物和上清液中的定量PCR测量结果证实了病毒滴定结果。在48和72 hpi时，N2a细胞中的细胞内病毒载量显著高于细胞外病毒载量。

总体而言，得出结论：所有三种PHEV分离株在RPD细胞中的复制效率均高于N2a细胞。虽然在感染后期阶段，两种细胞类型中达到了相当的细胞内PHEV滴度，但在整个感染过程中，在N2a细胞中观察到的细胞外病毒滴度显著低于RPD细胞。有趣的是，在接种VW572分离株的N2a细胞中观察到高细胞内滴度，但细胞外病毒没有增加。这些发现表明新的子代病毒粒子在细胞内积累，没有有效的排出。

PHEV-VW572和PHEV-Gent/PS412分离株均不在N2a细胞中进行细胞间传播

基于上述发现，假设PHEV-VW572在神经元细胞中进行细胞间传播，并且不释放细胞外病毒颗粒，作为免疫逃避策略的一部分。已知 Spike 蛋白诱导的细胞间融合对于β冠状病毒的有效细胞间传播很重要。为了检验这一假设，比较了PHEV-VW572和PHEV-Gent/PS412分离株在存在PHEV中和抗体的情况下进行细胞间传播的能力。由于PHEV-Gent/PS412和PHEV-Labadie分离株显示出相似的病毒复制动力学，仅使用PHEV-Gent/PS412进行这些实验，以便与PHEV-VW572分离株进行直接比较。如图2A所示，用病毒中和抗体处理以剂量依赖性方式显著抑制了PHEV在N2a细胞中的传播。PHEV-VW572感染细胞的百分比从约70%（对照）显著下降到约3.5%（处理后）。对于Gent/PS412分离株观察到类似的下降趋势，感染细胞的百分比从约20%下降到3%。提供了代表性的IF图片（图2B和C）。这些发现证明PHEV不在N2a细胞中进行细胞间传播，与使用的病毒分离株无关。因此，这些结果不支持我们的假设，即PHEV-VW572病毒粒子在细胞内积累并主要通过细胞间传播以逃避抗体检测。

PHEV-VW572，而非PHEV-Gent/PS412，在N2a细胞中使用MVB来源的外泌体通路进行排出

已知β冠状病毒利用溶酶体途径或分泌囊泡释放到细胞外环境。最近，研究表明PHEV可以利用多泡体（MVB）内多种病毒成分和宿主因子的封装来进行有效的细胞间通信。然而，尚不清楚这种策略是否在所有PHEV分离株中共享，或者特定的PHEV分离株仅将其用于在神经元中的有效传播。因此，接下来旨在检查PHEV-VW572和Gent/PS412分离株是否在神经元细胞中使用MVB来源的外泌体通路进行病毒排出。在病毒接种之前，用GW4869预处理细胞，GW4869是中性鞘磷脂酶（nSMase）的特异性抑制剂，对于外泌体生物发生和释放至关重要。如图3A所示，用10 μM GW4869处理细胞在48 hpi时显著降低了PHEV感染细胞的百分比，从75%降至30%，适用于VW572分离株。这与病毒滴度从10^4.6显著下降到10^3.5 TCID₅₀/mL相吻合（图3B）。相反，GW4869处理不影响Gent/PS412分离株的PHEV感染。提供了处理与未处理感染细胞的比较IF图片（图3C和D）。此外，在病毒接种1小时后用GW4869处理的细胞显示PHEV-VW572感染百分比有类似的降低，表明抑制剂在预处理时不影响病毒粒子的初始进入细胞。这些发现表明PHEV-VW572，而非Gent/PS412分离株，在神经元细胞中使用MVB来源的外泌体进行病毒排出。

使用透射电子显微镜（TEM）进一步研究和比较了两种分离株之间的病毒组装和排出步骤。发现PHEV-VW572在内质网-高尔基体中间 compartment（ERGIC）中组装，随着颗粒的发展和出芽，核衣壳沿着出芽区室的膜并置（图3E，上图）。此外，观察到细胞内囊泡中存在完整的病毒粒子。PHEV-Gent/PS412组装也发生在ERGIC中，但除了含有病毒粒子的囊泡外，在细胞质中也看到一些裸露的病毒粒子（图3E，下图）。在排出水平上，未检测到PHEV-VW572的明显病毒出口迹象。未看到病毒粒子的胞吐作用、质膜出芽或含有病毒粒子的细胞外囊泡（EVs）。相反，主要观察到在质膜附近融合的病毒-EV结构（图3F，上图）。相比之下，在PHEV-Gent/PS412感染细胞的质膜上看到了清晰的病毒出口位点和 Spike 形成（图3F，下图）。此外，通过TEM评估了细胞 upon PHEV感染后的质膜完整性。虽然感染PHEV-VW572的细胞显示出完整的质膜，但在PHEV-Gent/PS412感染的细胞中发现了质膜破坏和膜连续性受损（指示细胞裂解）的明显迹象。通过台盼蓝和碘化丙啶排除染色，在病毒感染期间未检测到N2a细胞质膜通透性的显著变化。总体而言，这些结果支持了PHEV-VW572（而非PHEV-Gent/PS412）利用MVB来源的外泌体通路在N2a细胞中进行有效排出和传播的概念。

PHEV-VW572使用外泌体标志物四跨膜蛋白CD81作为进入N2a细胞的受体

先前研究表明，在24 hpi时，只有10%的神经元细胞被PHEV感染。因此，假设在这些细胞中结合和/或进入水平可能存在限制。为了测试这一点，使用Dio标记的病毒粒子表征和比较了两种分离株与N2a细胞结合的动力学。如图4A所示，在结合后60分钟时，最多约15%–20%的细胞显示病毒粒子结合在其质膜上，这对于两种分离株都是如此。在那个时候，两种分离株之间结合的病毒粒子数量（约2个粒子/细胞）没有显著差异（图4B）。描绘了具有结合PHEV粒子的细胞的代表性IF图片（图4C）。由于通过IF观察到PHEV-VW572的病毒粒子聚集体结合到细胞上，通过TEM进一步表征了PHEV的进入机制。提供了PHEV病毒粒子的图片（图4D）。正如预期，病毒粒子显示出约81 nm直径的球形，存在具有典型“皇冠样”外观的螺旋核衣壳。发现病毒主要通过包被小窝的吞噬（指示网格蛋白介导的内吞作用）或直接融合进入细胞（图4E和F）。虽然通过TEM未观察到两种分离株之间进入机制的主要差异，但VW572病毒聚集体的存在可能表明通过多泡体可能进入。总体而言，这些发现表明PHEV与神经元细胞结合，与使用的病毒分离株无关。

接下来，确定了PHEV是否使用特定的受体或一组受体（仅存在于有限数量的细胞上）进行有效进入，以及这种策略是否由两种分离株共享。血管紧张素转换酶2（ACE2）已被确定为SARS-CoV-2的主要细胞受体。尽管如此，已知N2a细胞表达非常低水平的ACE2，并且通常需要将这些细胞与ACE2-GFP融合质粒转染以研究ACE2细胞定位和活性。与此一致，未观察到在用抗ACE2功能阻断抗体处理的细胞中PHEV感染减少，与未处理条件相比，与使用的分离株无关。由于β1整合素已被提议作为β冠状病毒的替代进入受体，测试了PHEV是否类似地使用它进入N2a细胞。然而，在阻断抗体处理后未观察到PHEV感染的显著减少。由于PHEV-VW572利用MVB-外泌体通路并将融合的PHEV-EVs释放到细胞外环境，测试了它是否可能使用外泌体受体进入细胞。几种四跨膜蛋白，包括CD81、CD63和CD9，已被广泛用作外泌体的标志物，用于病毒进入的运输。有趣的是，CD81富集的微区，连同CD9，是冠状病毒在神经元细胞中的优选进入位点。用抗CD81阻断抗体预处理细胞显著抑制了神经元细胞中的PHEV感染，在24 hpi时，但仅适用于VW572分离株（图4G）。提供了两种分离株以及CD81抗体处理后PHEV感染的比较IF图片（图4H和I）。最后，测试了靶向CD81的小干扰RNA（siRNA）是否可以有效减少神经元细胞中的PHEV感染。在用siRNA序列（包括CD81靶向和非靶向对照siRNA）转染24小时后，将细胞接种PHEV 24小时，并通过IF染色评估病毒蛋白表达。证明了在CD81 siRNA处理的细胞中PHEV感染显著减少，与未处理的细胞相比。总体而言，这些发现证实了PHEV-VW572进入神经元细胞是由CD81受体介导的。

DISCUSSION

神经感染性疾病是全球公共卫生的主要威胁。呼吸道病毒，如β冠状病毒，已被证明与广泛的急性、慢性和长期神经系统表现相关。迄今为止，与这些病毒感染相关的病理生理机制仍然知之甚少。使用PHEV（一种研究β冠状病毒的替代模型），研究并比较了三种不同病毒分离株在小鼠神经元细胞中复制周期的关键步骤。

首先，比较了这些分离株的复制动力学，并证明与对照猪肾细胞（RPD）相比，病毒感染的早期时间点在神经元细胞中受到限制。在整个感染过程中，对于PHEV-Gent/PS412和-Labadie分离株，未观察到感染细胞百分比的显著增加。相反，PHEV-VW572似乎克服了早期限制，如48 hpi时感染细胞百分比增加所示。这些结果表明PHEV-VW572在神经元细胞中的复制效率高于PHEV-Gent/PS412和-Labadie分离株。这些结果也与猪感染的临床结果相关。比利时PHEV-VW572是从一只患有呕吐消瘦病的猪中分离出来的。在猪经口鼻接种后，在三叉神经节和迷走神经节中确认了传染性PHEV抗原的存在。相比之下，PHEV-Gent/PS412是从一只显示呼吸道症状但无神经系统症状的猪中分离出来的。这可能解释了为什么该分离株在神经元中不能有效复制。对于PHEV-Labadie分离株，关于其从法国农场分离的信息有限。因此，对该分离株进行了完整的基因组表征，并基于PHEV-VW572、-Gent/PS412和-Labadie的全基因组序列构建了系统发育树。系统发育分析显示PHEV-Gent/PS-412/2020和VW572之间存在更近的关系，而PHEV Labadie与这两者更为 divergent。Gent/PS-412/2020的最接近亲属是LJ/2021和VW572。分离株Labadie和PHEV-Gent/PS-412/2020之间存在更大的遗传 divergence，如树中的分支长度所示。这与我们的数据显示PHEV Labadie和Gent/PS412在N2a细胞中具有相似复制动力学形成对比。PHEV-Labadie可能限制病毒在神经元中的表达和复制，作为病毒持久性的一种策略，这是其他冠状病毒共享的共同特征。需要对猪进行这些分离株的比较体内神经致病机制研究以进一步研究这一过程。

其次，证明PHEV-VW572感染导致高细胞内病毒滴度，同时细胞外病毒滴度没有增加。最初提出新的子代病毒粒子在感染后积累在细胞内，作为有效病毒传播的免疫逃避策略的一部分。然而，发现中和抗体消除了N2a细胞中的PHEV感染，表明病毒在细胞外传播而不是细胞间传播。这些结果与先前文献形成鲜明对比，文献显示SARS-CoV介导神经元细胞间传播以增强其神经侵袭性。近年来，外泌体被报道在促进β冠状病毒传播和调节宿主免疫反应中发挥重要作用。外泌体是小的细胞外囊泡（EVs），当质膜与通过内吞作用形成的MVB融合时释放到细胞外空间。这些囊泡根据其大小进行分类，范围可以从30到100 nm（外泌体）到100–1,000 nm（微囊泡）。在用外泌体生物发生抑制剂（GW4869）处理后，证明PHEV-VW572（而非Gent/PS412分离株）在神经元细胞中使用MVB来源的外泌体通路进行病毒排出。这些结果通过TEM进一步证实，在细胞内囊泡中看到了PHEV-VW572病毒粒子的存在。然而，在细胞表面未看到胞吐作用或EVs内病毒粒子释放的明显迹象。相反，观察到在质膜附近存在融合的PHEV-EV结构。这些结果与Li等人的研究部分一致，该研究通过EM证明了PHEV感染细胞上清液中存在PHEV修饰的外泌体。作者得出结论，PHEV主要使用外泌体进行细胞通信，特别是介导免疫刺激货物向未感染的神经免疫细胞转移。尽管如此，该研究仅包括一种PHEV毒株（PHEV-CC14），并且作者未能将其结论推广到其他PHEV毒株或分离株。相反，证明了PHEV组装和排出是分离株依赖性的，并且PHEV-VW572使用MVB来源的外泌体通路作为促进有效感染并克服N2a细胞中早期限制的策略。值得注意的是，抑制剂GW4869导致PHEV感染显著但部分减少（约50%），因此表明存在独立于GW4869敏感通路的替代病毒传播机制。

第三，表明PHEV与约15%–20%的N2a细胞结合，与使用的PHEV分离株无关。这些结果表明，在感染早期阶段（24 hpi）观察到的受限PHEV感染可能发生在结合水平。β冠状病毒进入是由病毒 Spike（S）蛋白与细胞受体结合启动的，随后S蛋白发生蛋白水解切割并释放融合肽，允许宿主细胞进入。由于特定细胞受体的使用通常负责病毒嗜性，通过执行功能阻断抗体实验筛选了PHEV进入细胞的潜在受体候选者。阻断ACE2和β1整合素受体对病毒感染没有影响，表明这两个受体不参与PHEV进入N2a细胞。对于ACE2，这并不奇怪，因为在这些细胞中检测到非常低水平的mRNA和蛋白表达。相反，Lv等人的研究表明β1整合素介导PHEV进入细胞。重要的是要注意，作者使用了与本研究检查的不同的病毒分离株。这再次强调了PHEV致病机制的分离株特异性差异。有趣的是，证明PHEV-VW572（而非PHEV-Gent/PS412分离株）使用四跨膜蛋白CD81受体进入N2a细胞。四跨膜蛋白在此过程中发挥关键作用，作为支架蛋白，通过在细胞膜上形成专门的微区来促进冠状病毒感染。例如，研究表明MERS-CoV使用包括受体、蛋白酶和CD9四跨膜蛋白的进入复合物进入细胞。中和抗体或siRNA处理后PHEV-VW572感染的抑制表明CD81是神经元细胞中病毒的主要受体。利用四跨膜蛋白富集微区进行有效细胞进入也在其他病毒中观察到，例如HIV-1。此外，CD81在细胞膜上的富集及其与神经元细胞中结构蛋白的共定位可能解释了为什么它作为PHEV的优选进入位点。CD81受体不参与PHEV-Gent/PS412分离株的进入进一步证实了细胞受体使用中存在分离株特异性差异。引人注目的是，CD81是EVs中最高度富集的蛋白质，即使它主要位于质膜内部。根据文献，因此假设CD81也可能在融合的PHEV-EVs上表达，并促进外泌体与靶细胞的融合，从而增强整体感染。这种机制可以解释为什么PHEV-VW572可以克服感染的早期阻断并随时间在N2a细胞中有效传播，而PHEV-Gent/PS412无法做到这一点。提供了PHEV进入和传播到N2a细胞的假设模型（图5）。最后，表明两种分离株都可以通过质膜直接融合或网格蛋白介导的内吞作用进入N2a细胞，如TEM所示。这些结果与先前报道的PHEV机制一致。尽管如此，重要的是要提到，由于与亚细胞结构的形态相似性，通过TEM准确识别冠状病毒粒子仍然具有挑战性。网格蛋白包被的囊泡具有与冠状病毒相似的大小，但缺乏核衣壳横截面，并且自由发生在细胞质中而不是在空泡内。这些诊断陷阱突出了严格的形态学标准以区分冠状病毒（如PHEV）与TEM研究中的细胞模拟物的必要性。总之，这项研究揭示了PHEV有效感染并在神经元细胞内传播的新机制。它也可能有助于进一步理解β冠状病毒的神经致病机制，以便开发针对神经系统表现的新治疗方法。