冠状病毒nsp3/nsp4双膜囊泡孔的结构形成路线图及其对多蛋白加工和复制/转录的启示

本综述系统阐述了冠状病毒复制细胞器——双膜囊泡（DMV）孔道形成的结构基础与分子机制。作者通过AlphaFold建模与冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）数据整合，首次提出未切割多蛋白前体（pp1a′/pp1ab′）通过形成十二聚体孔道前体结构，激活nsp5蛋白酶（Mpro

　　

ABSTRACT

冠状病毒复制发生在病毒感染期间产生的双膜囊泡（DMV）内。先前研究已确定这些DMV具有由病毒非结构蛋白nsp3和nsp4形成的特征性孔道，这些孔道促进新合成病毒RNA的输出。然而，由非结构蛋白nsp7至nsp16组成的复制机器如何被招募到DMV中仍然是一个谜。基于AlphaFold和先前确定的结构，我们构建了一系列模型，将DMV孔道的形成与nsp5蛋白酶对多蛋白的加工以及切割产物在DMV内的捕获联系起来。我们认为初始孔道由12个nsp3亚基、6个中间未切割多蛋白pp1a′（nsp4–nsp10）和6个pp1ab′（nsp4–nsp16）的各6个亚基形成。该初始结构的形成激活了紧密堆积环中交替nsp5亚基的蛋白酶功能，促进了nsp4–nsp5连接的初始反式切割。随后孔道成熟，并形成典型的nsp5二聚体，这些二聚体可以加工剩余的多蛋白。当蛋白酶激活发生在DMV闭合之后时，其切割产物（其化学计量与先前提出的以nsp15为中心的六聚体复制复合体一致）将被困在内部。

IMPORTANCE

冠状病毒与许多其他正义单链RNA病毒一样，依靠细胞内膜重塑来创建一个受保护的环境以进行高效复制。由此产生的双膜囊泡（DMV）具有由病毒非结构蛋白nsp3和nsp4形成的特征性孔道，而负责RNA复制的酶（包括聚合酶nsp12）则包含在内部。近期的结构研究阐明了这些孔道的性质，但聚合酶和其他病毒蛋白如何被招募到DMV中是我们当前知识的一个主要空白。在此，我们提出了一个新颖的、逐步的结构模型，说明孔道最初如何从未切割的多蛋白形成，蛋白酶活性如何被启动，以及病毒复制机器如何被捕获在DMV内。

INTRODUCTION

单链（+）RNA病毒胞质复制的一个统一特征是宿主细胞内膜重塑，以创建局部的保护性环境，促进 nascent 病毒RNA的生成和存储。在这些修饰中，最主要的是创建复制细胞器，可分为内陷的球状体（如黄病毒）或双膜囊泡（DMV）（如肠道病毒）。冠状病毒属于后者，其内质网（ER）膜重塑产生了一个DMV网络。越来越多的证据表明这些囊泡容纳了病毒RNA和复制所需的蛋白质，从而起到屏蔽RNA以避免触发免疫反应以及保护RNA和病毒蛋白免受降解的双重目的。研究集中在病毒跨膜非结构蛋白nsp3、nsp4和nsp6上，认为它们是膜重塑和DMV形成的主要驱动因素。从这项工作中得出的一般情况是，nsp3和nsp4主要负责膜倍增和DMV形成，而nsp6负责膜拉链以及将DMV簇栓系到脂滴和ER上。早期的严重急性呼吸综合征（SARS）DMV图像表明它是一个封闭的细胞器；然而，更详细的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）图像捕获了每个DMV膜中嵌入的多个 distinct 孔道，为新合成的RNA提供了必要的出口途径。鼠肝炎病毒（MHV）和SARS-CoV-2的低分辨率cryo-ET重建清楚地揭示了具有 distinct 六倍对称胞质冠并终止于突出 prong 状特征的孔道结构。对于SARS-CoV-2，这项cryo-ET工作还表明DMV形成和孔道形成是同步进行的，并且nsp3和nsp4是最小所需的病毒组件。最近的一个4.2 ?分辨率的cryo-ET结构进一步以更 detail 揭示了孔道，特别显示冠由12个nsp3亚基组成，锚定在一个跨越内膜和外膜的nsp4十二聚体排列上。

Nsp3和nsp4位于冠状病毒基因组的第一个开放阅读框（ORF1）上。ORF1涵盖了基因组的70%以上，编码两个病毒多蛋白，pp1a（nsp1–nsp10）和pp1ab（nsp1–nsp16）。它们通过位于nsp10和nsp12之间的核糖体移码来区分。两种多蛋白都被嵌入nsp3和nsp5中的病毒蛋白酶切割。对MHV和SARS的研究确定，前三个非结构蛋白（nsp1–nsp3）被nsp3的 papain-like 蛋白酶（SARS-CoV-2中的PLpro）有效切割，而多蛋白的其余部分（nsp4–nsp10，此处称为pp1a′，和nsp4–nsp16，称为pp1ab′）则由nsp5的主要蛋白酶（Mpro）以更受调控的方式切割。值得注意的是，对切割后的nsp5的生物化学研究表明，当二聚化时，该蛋白酶的活性显著更高，但启动nsp5成熟和多蛋白加工的因素尚未阐明。考虑到未切割的nsp5夹在膜结合蛋白nsp4和nsp6之间，应该预期对其初始活性有额外的限制，但这些限制尚未被探索且仍然知之甚少。关于DMV孔道，已清楚证明nsp3和nsp4之间的切割是孔道形成之前所必需的，但没有 comparable 的研究确定nsp4和nsp5之间的切割在孔道形成过程中的何时发生。因此，nsp5成熟是发生在孔道形成之前还是与之同步进行是一个悬而未决的问题。

一旦pp1a′和pp1ab′多蛋白被完全切割，产生的单个蛋白质nsp7–nsp16构成了病毒复制机器。至少，RNA聚合是由一个（nsp12）（nsp7）（nsp8）₂复合体执行的。nsp12、nsp13、nsp14和nsp16的额外酶结构域，在辅助因子nsp9和nsp10的帮助下，负责其他关键的病毒RNA复制功能，包括校对和mRNA加帽。先前，我们提出这些病毒蛋白围绕核酸内切酶nsp15组装，形成一个超过60个亚基的六聚体复合物。我们的建模表明该复合物有效协调了刚刚描述的各种功能。隐含地，这些蛋白质必须在DMV闭合之前被招募到DMV，以便在细胞器内部进行复制，尽管这可能如何实现尚不清楚，这代表了我们对冠状病毒复制认识的一个主要空白。

在此，我们从结构建模的角度处理孔道形成和多蛋白切割的问题。我们首先回顾了构建nsp3/nsp4孔道结构模型的尝试，强调了AlphaFold在此类努力中的成功和局限性。我们最终对Huang等人已发表结构中的 modeled prongs 提出了 modest 的修改。然后，我们检查了由侧翼膜结合蛋白nsp4和nsp6施加的对nsp5蛋白酶活性的限制，并描述了我们对似乎是孔道形成的多蛋白前体的发现，该前体克服了这些限制。我们提出，当这个孔道前体由六个pp1a′和pp1ab′的异源二聚体形成时，切割产物将被捕获在DMV内，并具有形成先前提出的六聚体复制复合物的适当化学计量。所提出模型的影响范围广泛，与膜重塑、nsp5蛋白酶活性的调控以及封闭囊泡内复制和转录复合物的形成直接相关。

RESULTS

SARS-CoV-2 nsp3 monomer

Nsp3是SARS-CoV-2病毒产生的最大蛋白质，有1,945个残基。虽然大多数单个结构域已通过X射线晶体学解析，但使用AlphaFold2.1预测了全长结构。大多数蛋白质（除了一些显著的例外）以高置信度预测，如预测局部距离差异测试（pLDDT）所测量，大多数结构域得分在70-90范围内。Ubl1（泛素样结构域1）、Mac1（宏结构域1）、Mac3、DPUP（Ubl2和PLpro之前的结构域）、Ubl2/PLpro、NAB（核酸结合结构域）和βSM（乙型冠状病毒特异性标记）的X射线结构在AlphaFold模型中 clearly 重现。强调该方法的成功，在这项工作完成后，获得了SARS-CoV-2 C端CoV-Y结构域（Y2、Y3和Y4）的结构（PDB 8ILC），该结构与AlphaFold预测也匹配。对于任何冠状病毒都没有可用结构的其他结构域，预测了TM1、3Ecto、TM2（更准确地描述为跨膜结构域2或TMD2的束）和Y1。βSM和Y1之间区域（包括TM1-3Ecto-TMD2）的pLDDT分数相对较低，为64.5，但值得注意的是，紧接βSM之后的残基（1318–1364）被预测为α-螺旋，残基1318–1349具有两亲性。TM1之前的残基（1385–1400）被预测形成第二个两亲性螺旋。

AlphaFold预测中最显著的失败是Mac2结构域，它与高度同源的SARS Mac2结构域（71%同一性，85%相似性）的X射线结构显著偏离。这是出乎意料的，因为SARS结构包含在AlphaFold训练数据集中，但这似乎仅限于全长nsp3的预测。分离结构域或Mac2及侧翼结构域的预测与SARS结构一致，使其pLDDT分数与其他结构域一致。Mac2与人类Paip1的异源二聚体的预测也与现有的SARS Mac2/Paip1 X射线晶体结构（PDB 6YXJ）一致。

通常，预测结构构象的变化，加上pLDDT分析，反映了结构域之间的显著灵活性。这在Ubl1和Mac1之间的高变区（HVR）（残基106-213）中最为 striking，该区域在AlphaFold预测中完全无序。此外，连接Mac1和Mac2（残基386–416）以及连接NAB和βSM（残基1194–1242）的环特别长。最终，这些接头提供了一组关于结构域之间最大距离和运动范围的约束，我们在检查孔道的nsp3组件时考虑了这些约束。

SARS-CoV-2 nsp3 dodecamer

对通过cryo-ET确定的SARS-CoV-2和MHV孔道结构的早期分析表明，胞质冠由nsp3六聚体组成，N端位于prongs中。由于AlphaFold可预测结构大小的实际限制（约5,000个残基），无法生成整个nsp3六聚体（11,670个残基）的模型，并且探索截短构建体仅取得有限成功。然而，4.2 ? cryo-ET结构的发布提供了令人惊讶的清晰度。六倍对称的冠实际上是nsp3的十二聚体，尽管大部分蛋白质结构未被解析。具体来说，C端Y1/CoV-Y结构域形成了冠的十二聚体基础和孔道的胞质部分。它由一个内部的Y1/Y2六聚体环（形成孔道）构成，该环被另一个外部的Y1/Y2六聚体环包围，形成了冠的基础。12个CoV-Y Y3/Y4结构域在基础之上交织，形成了冠的主体。冠通过TMD2嵌入外膜，与nsp4相互作用。这里我们注意到，在多聚体nsp3构建体的AlphaFold预测中，最 clear 的成功是内部Y1/Y2六聚体环的预测，与cryo-ET结构相比显示。

TM1之前的N端结构域仅对六个亚基部分解析，对其他六个亚基则完全未解析， implying 一定程度的无序，这可能反映了孔道的真实动力学或缺乏其他关键的稳定元素，如RNA或额外的宿主或病毒蛋白。或者，它可能只是获取和精修结构方式的人工产物（cryo-ET结构是从HEK293F细胞中nsp3–nsp4表达衍生的DMV确定的，而不是从感染细胞衍生的DMV）。明确解析的是，一个Ubl2/PLpro六聚体环位于CoV-Y十二聚体之上，构建起冠。Huang等人还将六个prongs中的每一个与来自一个亚基的Mac2、Mac3和DPUP结构域以及来自相邻亚基的NAB结构域进行了拟合。然而，这些prongs的分辨率相当弱（>9 ?），使得拟合 ambiguous。几个考虑因素导致我们重塑这部分结构。Huang等人假设prong密度主要由Mac2、Mac3和NAB结构域组成，并使用AlphaFold预测这些结构域的复合物，然后将其对接到密度中。这种拟合将NAB结构域置于距离冠基部假定的βSM结构域位置 implausibly 远的地方。相反，他们没有拟合Ubl1、HVR或Mac1结构域，而Zimmermann等人先前表明这些结构域对于prongs的正确形成至关重要。考虑到Mac1对应于MHV nsp3中唯一的Mac结构域，我们推断它是prong密度的重要组成部分，并且可能在两种结构中 similarly 定位。考虑到功能约束、MHV和SARS-CoV-2之间的异同以及所有可用的cryo-ET图，包括先前MHV和SARS-CoV-2的图，我们用Ubl1、Mac1、Mac2、Mac3和DPUP拟合了prongs，仅由于缺乏结构信息而省略了HVR结构域。此外，我们将NAB结构域定位在冠边缘的PLpro结构域之间。我们还对外膜胞质表面的βSM结构域和两个两亲性螺旋进行了建模，遵循先前未拟合的密度。作为原理证明，我们用44个残基的接头连接了NAB和βSM结构域。为建立 across diverse 冠状病毒的一致性，为MHV nsp3十二聚体构建了类似的模型。最终重塑的nsp3冠如图1b和c所示，并在补充材料和图S4、S5和S6中有更详细的描述。

SARS-CoV-2 nsp4 monomer

我们的nsp4模型与先前具有四个 distinct 结构域的AlphaFold模型一致。N端TM1是一个单一的α-螺旋，跨越残基1–27。随后是腔域（lumenal domain），一个由两个 distinct 叶组成的可溶性区域，通过一个9残基接头连接。先前指定的TM2/TM3/TM4螺旋被AlphaFold预测为一个5螺旋束，跨越残基277–398。为简单起见，我们将此区域称为TMD2，具有特定的螺旋α1–α5。最后，AlphaFold预测的C端结构域（CTD）是另一个可溶性区域，它重现了现有的X射线结构。全蛋白的平均pLDDT分数为83.0。

在预测结构中，TM1都不与TMD2相互作用。该构象反而与nsp4与DMV双膜的结合一致，其中nsp4 N端是胞质溶胶的，TM1位于外膜中，腔域位于膜间隙中，TMD2位于内膜中，nsp4 CTD暴露于DMV内部。因此，AlphaFold预测的nsp4结构的整体拓扑结构与详细孔道结构中看到的拓扑结构一致。预测结构的细节，如腔域和TMD2，也通过cryo-ET结构得到确认，唯一显著的差异是TMD2中螺旋α1的构象变化，下文将更详细讨论。

SARS-CoV-2 nsp4–nsp5–nsp6–nsp7 monomer

为了研究多蛋白内nsp5蛋白酶所受到的约束，我们生成了未切割的nsp4–nsp5–nsp6–nsp7构建体的AlphaFold模型。pLDDT略微下降至平均77.0，但nsp5和nsp7的X射线结构被很好地重现，并且nsp6被预测形成8螺旋束。多蛋白的整体组织在单个结构域之间显示出一些灵活性。然而，在所有预测结构中，nsp4 TMD2与nsp6对齐，就像结合到共同的膜上一样。与切割的nsp4预测不同，多蛋白中nsp4的腔域在其N叶和C叶之间（由残基124–132连接）采用了一种构象，该构象使TM1与nsp6螺旋束相关联。这将更 consistent 与单个ER膜的结合，而不是DMV双膜，使得nsp5、nsp7、nsp4 N端和nsp4 CTD位于胞质溶胶中。观察到这种构象变化是由nsp4腔域驱动的，这与Klatte等人先前对该结构域的表征一致。

已知nsp5蛋白酶二聚体的活性显著高于单体，但这项工作的一个主要结论是，尽管连接nsp4和nsp5的环相对较长且灵活（残基488–510），但这些蛋白质的顺式切割似乎不可行。连接环上的切割位点（残基500–501） simply 无法到达蛋白酶活性位点，而不会损害蛋白酶结构的完整性。类似地，在任何情况下，nsp5和nsp6蛋白质在残基807–808处的顺式切割似乎都不可能。因此，在这两种情况下，切割必须通过与第二个多蛋白或已切割的nsp5二聚体的蛋白酶相互作用来进行。

SARS-CoV-2 nsp4–nsp5–nsp6–nsp7 dimer

切割的nsp5二聚体已通过X射线晶体学对多种冠状病毒进行了详尽的研究。二聚体与单体相比蛋白酶活性增加的一个关键因素是一个单体的N端胺如何与另一个单体的S1活性位点口袋结合。这已被证明对于稳定SARS和SARS-CoV-2的活性位点至关重要，增强了蛋白酶的催化活性。我们考虑了典型的nsp5二聚体是否可以在未切割的nsp4–nsp5–nsp6–nsp7多蛋白内形成，如果可以，它是否能够自我切割。使用一个截短的构建体，其中移除了nsp4 TM1和腔域，我们生成了未切割二聚体的AlphaFold模型，该模型具有 approximately C2对称性。在该模型中，nsp4和nsp6对齐，就像结合到共同的膜上一样，典型的nsp5二聚体定向为其结构域1靠在膜上，结构域3最暴露于胞质溶胶。

可以看到nsp4–nsp5切割位点P1 Q500残基占据了活性位点的S1口袋。然而，完整的nsp4–nsp5切割肽没有正确对齐，并且关键的是，由于nsp5二聚体本身的约束，P1′ S501切割位点残基无法定位在S1′口袋中。因此，该二聚体无法切割nsp4/nsp5。为了强调这一点，对膜结合二聚体的100 ns分子动力学（MD）模拟在整个模拟过程中保持了谷氨酰胺残基和S1位点之间的这种相互作用。我们从这一分析中得出结论，未切割的二聚体不仅没有切割的nsp5 N端来稳定S1位点和激活蛋白酶的优势，而且它有未切割的nsp4 C端谷氨酰胺残基阻止该位点作用于任何其他底物。

如果来自扩展多蛋白的额外空间和构象约束，或者潜在的nsp3相互作用被证明更具主导性，则应考虑这种典型的二聚体可能甚至在某些切割已经通过不同途径发生之后才会形成。强调这一点，MERS的nsp5蛋白仅 weakly 二聚化，而是依赖于配体诱导的二聚化机制。确实，如图3d所示，取相同的nsp4–nsp5–nsp6–nsp7二聚体，并假设至少一个nsp4/nsp5切割已经通过某种尚未确定的机制发生， resulting nsp5 N端胺 then 激活未切割亚基的蛋白酶。可以观察到切割单体的nsp5–nsp6和nsp6–nsp7切割位点靠近激活的蛋白酶，并且可能是潜在的底物。该分析表明需要初始的nsp4–nsp5切割事件，但该事件不是通过典型的nsp5二聚体进行的。多蛋白之间的某些其他关联必须负责。

SARS-CoV-2 nsp4 dodecamer

与nsp3一样，我们最初的假设是孔道的nsp4组件是六聚体的。基于我们对nsp4单体的预测结构以及先前表明nsp3与nsp4腔域相互作用的工作，我们推断TM1必须位于外膜中，将腔域定位在膜间隙中。这表明嵌入内膜的孔道部分将由nsp4 TMD2结构域的六聚体形成，nsp4 CTD暴露于DMV内部。因此，我们使用了一个跨越nsp4残基256–500（TMD2和CTD）的截短构建体。AlphaFold indeed 预测了几个具有孔道状特性的 plausible 六聚体结构，但没有一个与可用的cryo-ET图完全一致。然而， upon close examination of the MHV map，我们识别出膜间隙内的密度，该密度在大小上与nsp4腔域相似，但表明nsp4实际上是十二聚体的，而不是六聚体的。不幸的是，十二聚体nsp4（残基256–500）的AlphaFold预测没有产生具有预期C6对称性的结构。Huang等人的详细孔道结构证实nsp4组件确实是一个十二聚体，其特征是一个中央六聚体环与一个外部六聚体环交织。虽然未能产生完整的十二聚体nsp4组装体，但AlphaFold实际上准确预测了内部六聚体环的结构，如与cryo-ET结构相比所示。

SARS-CoV-2 nsp4–nsp5–nsp6 dodecamer

由于最初的nsp5切割事件似乎尚未解决，我们考虑了在nsp4/nsp5切割之前形成孔道的可能性。我们使用AlphaFold进行的初步探索也考虑了未切割的nsp4–nsp5–nsp6（截短至残基256–1,042）的六聚体。AlphaFold生成了一个特别引人注目的模型，该模型由一个内部的nsp4 TMD2环组成，周围是一个外部的nsp6环。两个跨膜结构域通过一个内部的、紧密堆积的溶剂暴露环连接，该环由nsp4 CTD形成，并被一个更大的由nsp5形成的紧密堆积环包围。与nsp3/nsp4孔道的新兴拓扑结构一致，在该模型中，nsp5和nsp4 CTD都将暴露于DMV内部。

随着我们理解到孔道nsp4组分的化学计量是十二聚体而不是六聚体，我们发现可以 straightforward 地设想类似紧密堆积的多蛋白环，其尺寸不断增加。例如，基孔肯雅病毒蛋白nsP1已通过cryo-EM显示形成十二聚体环。我们使用AlphaFold查看了一系列较小的聚集体（六聚体、八聚体、十聚体），并且在每种情况下都预测了类似排列的环。不幸的是，nsp4–nsp5–nsp6的十二聚体排列或任何大于六聚体的环都超出了AlphaFold的实际限制。为了生成这样的模型，我们 instead resorted to a simple geometric expansion of the nsp4–nsp5–nsp6 hexamer。这是通过定义六聚体内每个亚基的质心，测量相邻亚基之间的距离，并平移和旋转这些亚基的 duplicate sets 以形成一个十二聚体环来执行的，其中保持该距离。从这个起点进行结构精修（如下所述）导致了如图4b所示的 fully optimized 构建体。类似的方法应用于基孔肯雅病毒nsP1六聚体的AlphaFold模型，以产生一个很好地重现cryo-EM结构的十二聚体模型。

与早期的MHV和SARS-CoV-2 cryo-ET图相比，这种十二聚体排列似乎与内膜孔道的整体直径一致，并首次暗示了这些孔道可能如何形成。一旦Huang等人的详细孔道结构可用，最终完全切割孔道的排列就清楚了，我们的注意力转向了未切割模型是否与该结构一致。

如上所述，孔道结构的nsp4十二聚体组件可以描述为一个内部六聚体环与一个外部六聚体环交织。基于C端结构域的位置，该结构形成的一个明确要求是内部nsp4六聚体必须从nsp5上切割下来。然而，同样清楚的是，外部六聚体环可以仍然是未切割多蛋白的一部分，并保持孔道结构的完整性。因此，在该模型框架内，孔道的成熟至少需要交替的nsp4/nsp5位点的切割。

这提出了一个有趣的拓扑学问题和一个逆向工程过程的机会。在nsp4–nsp5–nsp6六聚体中，我们看到了一个结构域交换发生，其中TMD2采用开放构象，α1螺旋以显著角度（约60°）突出，与相邻的α2–α5 TMD2束相互作用。这种开放构象在Huang等人解析的结构中的内部和外部六聚体中都可以看到，其中在内部六聚体中清楚地观察到结构域交换。此外，检查该结构中的一对交织的nsp4亚基，开放构象的效果是将一个亚基向内投射，另一个向外投射，导致两者相互交叉。

我们认识到，在将AlphaFold预测的nsp4–nsp5–nsp6六聚体转换为十二聚体时，这可能如何表现存在一些模糊性。我们考虑了三种可能性：一种是所有12个亚基都采用开放构象，一种是它们都采用闭合构象，一种是只有交替的亚基采用开放构象。整体结构没有变化，除了α1螺旋是开放还是闭合。从这三种可能性中，可以看出所有12个亚基都处于开放构象的结构在nsp4/nsp5切割后没有直接路径达到交织的最终孔道结构。然而，在一种只有交替亚基采用开放构象的排列中， upon cleavage of the nsp4–nsp5 linkages from those same six subunits，该结构将有一条简单的途径来采用成熟孔道构象。从这个角度来看，图4b所示的模型可以被认为是一个多蛋白二聚体的六聚体环，反映了nsp3十二聚体的情况。

该模型最终与Huang等人结构中的nsp4腔域和我们重建的nsp3十二聚体模型合并。cryo-ET结构中缺失的nsp4 TM1螺旋也被添加，与图中可辨别但先前未建模的密度一致，平行于nsp3 TM1螺旋。

SARS-CoV-2 uncleaved pp1a’/pp1ab’ model

创建了十二聚体nsp4–nsp6模型后，我们考虑了对其余未切割多蛋白进行建模。这个扩展模型可以源自pp1a′（nsp4–nsp10）或pp1ab′（nsp4–nsp16）或两者的组合。我们认为某些已知的蛋白质-蛋白质相互作用在这种情况下可能被保留， creating a degree of preorganization that would facilitate efficient formation of the replication complex upon polyprotein cleavage。根据cryo-EM和X射线结构，nsp7和nsp8、nsp7和nsp12、nsp8和nsp12、nsp8和nsp13、nsp9和nsp12、nsp10和nsp14以及nsp10和nsp16之间的相互作用 well characterized，nsp15六聚化也是如此。

从优化的十二聚体环中提取的nsp4–nsp5–nsp6二聚体开始，似乎将两个亚基扩展到完整的pp1ab′多蛋白会太庞大，并且只提供有限的亚基间相互作用。相反，将两者扩展到较小的pp1a′多蛋白将 well tolerated，但提供的额外蛋白质-蛋白质相互作用很少