沙门氏菌fepB突变体感染中秀丽隐杆线虫AWC神经元介导的化学感应负向调控休眠

本综述深入探讨了在沙门氏菌fepB突变体（ΔfepB）感染条件下，模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）如何通过其AWC嗅觉神经元感知病原体信号，并揭示了该感知过程如何引发行为可塑性与发育决策（如dauer幼虫形成）的深刻变化。研究阐明了化学感应基因（如odr-7, ceh-36, daf-11, tax-2, tax-4）的上调是这一过程的关键分子基础，为理解宿主-病原体互作（Host-Pathogen Interaction）及神经免疫调节提供了新颖视角。

　　

摘要 (ABSTRACT)

先前的研究表明，连续8天暴露于沙门氏菌肠血清型 Typhimurium 的fepB突变株（ΔfepB）会负向调控秀丽隐杆线虫种群第二代中dauer幼虫的形成。本研究旨在深入探索线虫的特定化学感应神经元如何识别ΔfepB菌株并在感染响应中发生可塑性变化。研究团队观察到线虫对致病性野生型沙门氏菌（WT-STM）的嗅觉偏好。然而，长时间的暴露显示，线虫在ΔfepB菌株上的草坪占据率增加，并且其联想学习反应优于WT-STM对照组。在感染ΔfepB 24小时后，化学感应基因odr-7、ceh-36、daf-11、tax-2和tax-4的表达上调。通过使用嗅觉神经元缺陷的线虫突变体进行实验，研究强调了AWC神经元在感知ΔfepB菌株中的核心作用，并最终介导了线虫第二代的可塑性。此项研究揭示了线虫嗅觉神经元在遭遇沙门氏菌 Typhimurium 时的检测机制及其相应的行为调整，突出了线虫化学感应神经元与调控宿主生理以求生存的细菌信号之间的紧密联系。

引言 (INTRODUCTION)

食物对于秀丽隐杆线虫及其它任何生物的最佳适应性和生存都至关重要。然而，在生态位中搜寻食物时，被捕食或病原体攻击是常见情况。作为自由生活的土壤线虫，秀丽隐杆线虫通常存在于复杂环境中（如腐烂的植被、水果和堆肥），与致病和非致病微生物紧密关联，这为其生存创造了敌对情境。不过，秀丽隐杆线虫拥有一个发育良好的化学感应系统，其302个神经元使其能够定位食物、感知危险或其自然栖息地中的其它动物。这类化学感应神经元将翻译从环境中感知到的化学线索，并启动神经内分泌信号传导，使线虫能够区分可食用和受病原体污染的食物，驱动物理回避行为，并影响其发育选择。

沙门氏菌 Typhimurium 14028s菌株（WT-STM）是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌，已知可在秀丽隐杆线虫中引起持续性感染并导致其死亡。先前的研究发现，用ΔfepB 沙门氏菌 Typhimurium 菌株感染线虫，会导致其第二代中dauer幼虫发育显著增加，与WT-STM感染相比尤为明显。在病原体持续感染下，这种表型一直持续到第四代。在沙门氏菌中，fepB基因是ABC转运蛋白（FepBDGC操纵子）的一部分，参与铁摄取，特别是铁离子的摄取。它参与运输铁载体肠菌素，该分子帮助细菌在铁可用性有限（如宿主细胞内）的环境中获取铁。该基因的缺失破坏了铁获取，导致细菌持久性降低、宿主免疫反应增强以及线虫生存能力提高。研究团队还用ΔftnB和Δbfr沙门氏菌菌株（铁蛋白家族基因，对沙门氏菌 Typhimurium 的细胞内生存和毒力至关重要）感染线虫，以检测铁在线虫dauer幼虫发育中的直接或间接参与，但未观察到像ΔfepB那样高的dauer幼虫水平。最终发现，WT-STM中的fepB基因通过TGF-β信号通路在持续感染期间负向调节dauer幼虫的发育，强调了食物提供信号在感染期间调节线虫正常生理的作用。然而，问题依然存在：秀丽隐杆线虫如何识别影响其正常发育的ΔfepB菌株？本研究探讨了线虫对ΔfepB菌株化学感应响应背后的机制，以及这种化学感应如何影响其在感染期间的发育决策。对细菌发出信号和机体生理学的研究有助于理解沙门氏菌发病机制中复杂的宿主-病原体相互作用，未来可在更高等生物中进行探索。

结果 (RESULTS)

沙门氏菌fepB突变体感染改变了秀丽隐杆线虫的行为

秀丽隐杆线虫能够识别其病原体并产生特定的保护性反应，如回避、抵抗或分泌抗菌肽（AMPs）、活性氧物种（ROS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），以在敌对条件下实现最佳生存。先前的研究表明，ΔfepB感染在第二代中引起了行为可塑性，同时在感染条件下比WT-STM具有更好的生存能力。这促使研究团队调查在感染期间第一代总种群中的线虫行为。为了解决这个问题，研究团队在感染条件下观察了线虫的行为，即线虫在1-2小时时间间隔内对食物的偏好，旨在了解其嗅觉偏好。研究发现，线虫对WT-STM表现出强烈的选择，但不偏好ΔfepB菌株。接下来，研究团队想探索在 prolonged infection conditions 下线虫的行为。发现持续暴露改变了线虫的行为反应，与WT-STM草坪相比，ΔfepB菌株的草坪占据率增加。总的来说，行为研究表明WT-STM吸引线虫，但持续暴露表现出从WT-STM草坪到ΔfepB草坪的草坪厌恶增加。

秀丽隐杆线虫对ΔfepB沙门氏菌菌株表现出增强的嗅觉功能

许多报告显示，秀丽隐杆线虫能够识别并记住其病原体，以在该条件下实现生存和适应。致病菌，如沙门氏菌肠血清型、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌和苏云金芽孢杆菌，通过改变对非致病性大肠杆菌 OP50 的取食偏好，诱导线虫发展出厌恶性学习行为。为了测试线虫识别病原体的能力，研究团队将线虫暴露于两种不同条件：（i）幼稚条件，线虫被放置在大肠杆菌 OP50 接种的线虫生长培养基（NGM）平板上；（ii）训练条件，线虫被放在NGM平板上，平板一侧接种大肠杆菌 OP50，另一侧接种WT-STM/ΔfepB/ΔfepB_c，并孵育48小时以适应这些病原体的气味。在这里，观察到暴露于ΔfepB菌株48小时的线虫表现出比WT-STM显著更强的学习行为。各种报告显示，在线虫中，tph-1（色氨酸羟化酶，一种参与血清素生物合成的限速酶）在各种神经功能中起着至关重要的作用，其表达高度受环境条件（即饥饿、食物质量和温度）的调节。在病原体暴露下，发现了依赖于经验的tph-1表达变化。在本研究中，还观察到被ΔfepB菌株感染的线虫与WT-STM相比，以时间依赖的方式表现出上调的tph-1表达，这意味着针对突变沙门氏菌菌株的线虫嗅觉增强和学习行为更好。

秀丽隐杆线虫中AWC介导的对ΔfepB菌株的趋化性

秀丽隐杆线虫在1-2小时内对WT-STM表现出强烈的嗅觉偏好，表明化学感应神经元参与病原体识别。三种嗅觉感觉神经元，amphid wing A, B, and C (AWA, AWB, and AWC) 在线虫嗅觉中起着重要作用。为了确认这些特定神经元中的任何一个在感知细菌菌株中的显著参与，研究团队首先检查了在嗅觉神经元介导的嗅觉中起重要作用的特定基因的mRNA表达，以及时间依赖方式下的感觉转导基因。例如，odr-10编码一个G蛋白偶联受体，专门在AWA神经元中表达，ODR-10位于AWA纤毛末端的尖端，是AWA介导的化学感应所必需的，特别是用于感知二乙酰，因为这种ODR-10是二乙酰的受体，而odr-10突变体线虫对二乙酰表现出AWA缺陷反应。odr-3编码G蛋白α亚基，并在许多嗅觉和伤害感受器受体下游起作用。odr-3基因的突变表现出由AWA、AWB、AWC和amphid single cilium H (ASH) 神经元介导的缺陷反应。CEH-36是一种转录因子，在AWC神经元的终末分化中起着至关重要的作用，该基因的突变导致对AWC感应气味的缺陷反应。此外，还检查了daf-11基因的mRNA表达，该基因是AWB和AWC神经元介导的嗅觉行为所必需的；据报道，AWC神经元通过DAF-11鸟苷酸环化酶途径利用主要信号转导途径，并且线虫中daf-11基因的突变表现出对AWC感应气味的缺陷反应。然而，大多数化学感应神经元使用环核苷酸门控离子通道或瞬时受体电位（TRP）通道进行感觉转导。由tax-2和tax-4基因编码的环核苷酸门控通道以及编码TRP通道的osm-9和ocr-2用于化学感应信号转导。在这里，观察到差异基因表达模式，即在感染ΔfepB菌株24小时后，odr-10、ceh-36、daf-11和tax-2/tax-4基因上调，表明化学感应神经元强烈参与感知沙门氏菌菌株。接下来，当研究团队用具有嗅觉神经元缺陷的线虫进行草坪厌恶反应实验时，发现随着时间的推移，与WT-STM草坪相比，线虫的ceh-36突变体仍然留在ΔfepB菌株草坪中，表明ceh-36（AWC神经元特异性基因）参与感知突变沙门氏菌菌株。为了进一步确认AWC神经元在识别fepB突变菌株中的显著参与，研究团队将AWC（?）线虫暴露于感染条件，并注意到在感染后36和48小时，AWC（?）菌株无法显示出对fepB突变菌株的草坪厌恶行为。总的来说，数据暗示了AWC神经元在线虫对沙门氏菌的化学感应中的作用，特别是在持续感染条件下识别fepB突变沙门氏菌菌株。

AWC神经元参与秀丽隐杆线虫对ΔfepB菌株的发育可塑性

暴露于压力环境刺激，如高温、信息素、食物短缺和过度拥挤，会触发形成称为dauer的替代第三幼虫阶段，使线虫能够在恶劣条件下生存。病原体也作为压力源，可以影响线虫的发育可塑性。dauer现象背后的分子机制已得到很好理解，但化学感应神经元在沙门氏菌感染下的dauer幼虫中的作用需要进一步研究。从先前描述的线虫行为研究中，可以清楚地看到AWC神经元在感知ΔfepB菌株中发挥了重要作用。此后，研究团队想了解这种神经元在调节线虫可塑性中的参与。使用嗅觉缺陷突变体和N2线虫，研究团队检查了在对照和感染条件下的dauer幼虫发育。有趣的是，观察到在第二代种群中，ceh-36和AWC（?）线虫的dauer幼虫发育减少。然而，在fepB突变沙门氏菌菌株感染条件下，总种群没有改变。总的来说，研究阐明了化学感应神经元，特别是AWC，在暴露初始阶段识别沙门氏菌fepB突变菌株中的参与。这种识别可能是通过激活daf-11和tax-2/tax-4信号通路发生的。 upon prolonged exposure, these neurons appear to contribute to behavioral plasticity. However, the specific mechanism by which AWC neurons detect the fepB mutant, whether through a secreted bacterial effector molecule or the FepB protein itself, remains to be clarified in future studies.

此处，图5C是一个示意图，表明秀丽隐杆线虫AWC神经元在第一代中感知fepB突变沙门氏菌菌株的显著参与，以及改变的行为反应导致在针对ΔfepB沙门氏菌菌株的线虫第二代中诱导休眠。

讨论 (DISCUSSION)

秀丽隐杆线虫生活在一个复杂的环境中，这使它们能够进化出特定的机制来识别并产生分子和行为防御反应，以实现最佳生存。喂食不同的微生物，无论是致病性的还是非致病性的，对秀丽隐杆线虫的生命周期都有不同的影响。食物来源的类型可以改变线虫的正常行为和发育过程。

报告显示，革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌通过肠道中的定植和增殖缓慢杀死线虫，或通过分泌有毒代谢物快速杀死线虫。粘质沙雷菌，另一种革兰氏阴性机会性人类病原体，据报道会在6天暴露后导致线虫肠道扩张并死亡。对秀丽隐杆线虫进行了一项广泛的研究，以了解与沙门氏菌 Typhimurium 相互作用的不同方面，沙门氏菌 Typhimurium 是另一种强效的革兰氏阴性人类病原体，已知会在人类中引起胃肠炎。沙门氏菌 Typhimurium 是一种众所周知的病原体，可在秀丽隐杆线虫肠道中引起持续性感染，导致线虫死亡。用沙门氏菌 Typhimurium 菌株感染线虫显示其在肠道中的持久性，影响其寿命并最终导致死亡。这类细菌还形成由生物膜形成介导的静态聚集体，可以通过抑制宿主免疫反应帮助其延长体内存活。在哺乳动物系统中毒力较弱的突变沙门氏菌菌株在线虫中也显示出减弱的毒力。用沙门氏菌 Typhimurium 感染线虫揭示了种系发育缺陷。先前的研究表明，删除沙门氏菌 Typhimurium fepB基因改变了线虫生理，并在22°C下持续感染8天后的第二代中诱导了dauer幼虫发育。此外，观察到被ΔfepB菌株感染的线虫具有更好的生存能力，从线虫肠道中显著清除细菌，甚至与WT-STM对应物相比增强了早期先天免疫反应，表明ΔfepB菌株的毒力特性较低。fepB基因在沙门氏菌发病机制中起着至关重要的作用。Palacios等人和Zhang等人的研究报告了fepB基因在病原体毒力中的重要性。在肺炎克雷伯菌中，删除fepB基因显示出比野生型细菌更减弱的毒力特性。在大肠杆菌中，影响铁载体肠菌素导入系统的fepB突变，以及用这种细菌喂食线虫，会导致氧化应激，损害线粒体功能并延迟线虫发育。

秀丽隐杆线虫发展了一个独特的传感器系统，以在其栖息地中导航并响应各种环境线索，包括气味、盐、温度、信息素、气体、机械刺激等。为了抵御病原体的攻击，线虫通常采用逃跑反应，显示出回避或战斗反应，通过分泌抗菌肽，即AMPs、iNOS或ROS，以实现更好的生存。通常，这些回避或厌恶性学习行为是线虫针对病原体的节能生存策略，并降低了感染的机会。某些团体，如Zang等人、Kaletsley等人、Sengupta等人和Im Choi等人报告说，线虫在其环境中表现出对病原体分泌气味的回避，并朝着熟悉的非致病性细菌气味移动；特定细菌会引发线虫嗅觉偏好的特定变化，导致联想学习行为，通过简单地避免第二次接触相同的病原体暴露。此外，来自致病菌（如铜绿假单胞菌、弗氏假单胞菌等）的小核糖核酸（sRNA）可以调节线虫的回避行为，并将信息传递给其后代以更好地生存。从最初的研究中，研究团队好奇地想了解这种ΔfepB菌株如何在第一代中影响线虫的生理，以及它们对ΔfepB菌株的化学感应，以及在持续感染下第二代中的发育可塑性。使用二元食物选择 assay，研究团队首先检查了线虫对细菌病原体的行为。细菌释放的挥发性气味主要决定了线虫的初始接近。观察到线虫的行为改变，它们显著地远离ΔfepB菌株，与WT-STM对应物相比，显示出对WT-STM的初始强烈嗅觉偏好。然而，这种对fepB沙门氏菌突变菌株的嗅觉偏好在长时间暴露下的线虫中发生了变化，这可以调节它们的行为反应。由于这类研究破译了线虫对WT-STM的强烈偏好，研究团队有兴趣了解线虫记住和识别这种病原体的能力。研究揭示了线虫的嗅觉厌恶性学习行为，线虫可以在第二次暴露于相同病原体时避免它。在本研究中，在给线虫48小时的训练，包括非致病性大肠杆菌 OP50、致病性WT-STM及其突变菌株ΔfepB后，线虫显示出对ΔfepB菌株比WT-STM对应物增加的联想学习行为，并且fepB的互补菌株表现出表型恢复。此外，观察到与野生型沙门氏菌相比，针对ΔfepB菌株以时间依赖的方式上调了tph-1基因（在线虫ADF神经元中合成血清素所需，提供线虫的嗅觉厌恶性学习行为）的表达。行为研究数据暗示了线虫判断食物质量的强大能力，离开致病菌草坪，并通过摄取非致病性饮食发展联想学习行为。这一发现促使研究团队探索线虫化学感应神经元的参与，特别是嗅觉神经元，在识别这些细菌菌株并显示出观察到的表型。

秀丽隐杆线虫拥有发育良好的化学感应神经元，以感知病原体分泌的气味，这些气味是吸引性的或排斥性的。三种嗅觉化学感应神经元在线虫的头部区域参与感知其附近的挥发性气味。主要检测水溶性线索（味觉神经元）的神经元显示出与感知环境中挥发性（嗅觉神经元）线索的神经元不同的形态。味觉神经元，即amphid single cilium E, G, H, I, J, K (ASE, ASG, ASH, ASI, ASJ, ASK) 和 amphid dual ciliated ending F and L (ADF, L) 在其amphid开口处具有简单单或双纤毛末端，与环境直接接触。三对amphid感觉神经元，即AWA、AWB和AWC，可以检测其环境中的挥发性化学线索。这些神经元在amphid开口附近的鞘细胞中具有精细的纤毛感觉末端，具有大的表面积以最佳检测挥发性气味。AWA和AWC允许检测吸引性气味，而AWB感知排斥物。研究团队最初检查了特定化学感应基因（odr-10、odr-3、ceh-36和daf-11）的mRNA表达，这些基因已知在化学感应神经元AWA、AWB和AWC介导的嗅觉中起重要作用，以及感觉转导基因（tax-2、tax-4、osm-9和ocr-2；表2）以时间依赖的方式。观察到在线虫中，在不同感染后时间点暴露于fepB突变细菌菌株后，有关基因的差异表达。这些表达变化随时间变化，表明靶向神经元在宿主反应中的参与。

为了进一步验证化学感应神经元在识别fepB突变沙门氏菌菌株和调节线虫对突变菌株行为中的强烈参与，研究团队使用了线虫突变体（odr-7、odr-3、che-36和tax/2/4），这些突变体具有嗅觉神经元缺陷。发现以时间依赖的方式，ceh-36突变体线虫未能响应fepB突变沙门氏菌菌株，即使在48小时的持续感染下，这强调了AWC神经元可能参与感知沙门氏菌突变菌株，因为Ceh-36转录因子有助于AWC神经元的终末分化，并导致线虫中AWC介导的嗅觉。为了确认AWC神经元的强烈参与，研究团队将AWC消融的线虫暴露于类似感染条件，使用所有细菌菌株。研究团队检查了对ΔfepB菌株的厌恶反应。在这里，突变体线虫无法在感染后期显示出对所述病原体的草坪回避行为，支持了AWC嗅觉神经元在感知ΔfepB菌株中起重要作用的观察。

随着环境条件的改变，秀丽隐杆线虫也必须改变其发育和行为程序。特定化学感应基因的表达和灵活调节对于塑造线虫的特定行为至关重要。然而，这些高度动态的化学感应基因表达的调节广泛取决于外部和内部条件的变化。在自然环境中，食菌线虫秀丽隐杆线虫遇到不同的微生物，如病原体、捕食者、竞争者或寄生虫。有趣的是，尽管化学感应神经元数量最少，秀丽隐杆线虫仍能导航并生存于其主要是微生物的自然环境中。化学感应神经元参与线虫行为可塑性的研究已经进行，但某些微生物或其分泌产物在被特定神经元识别后如何改变发育可塑性需要更多研究。先前的研究表明，fepB突变沙门氏菌感染通过激活TGF-β信号通路负向调节第二代线虫种群中dauer幼虫的发育。通常，这些dauer幼虫提供了一种回避策略，并在反复暴露于细菌后世代传递给后代，此时逃脱是不可能的。在大多数情况下，病原体定植于线虫肠道，引起持续性感染，触发线虫进入dauer状态。铜绿假单胞菌 PAO1、沙门氏菌 Typhimurium MST1（一种中等毒力菌株）诱导了dauer幼虫形成，而铜绿假单胞菌 PA14（一种对多种生物引起感染的高毒力菌株）在初始暴露时导致线虫死亡；甚至细菌小RNA也是dauer诱导所必需的，为微生物调节线虫发育提供了机制见解。dauer幼虫发育背后的分子机制已得到明确定义，但病原体感染如何调节线虫的休眠需要更多研究。感觉神经元也参与dauer决策并改变线虫的生命周期。然而，线虫化学感应在相同感染条件下改变生理中的参与尚未得到广泛探索。此后，当研究团队将嗅觉缺陷突变体线虫暴露于持续感染8天（F2代）以检查dauer幼虫形成时，发现在ΔfepB菌株下，具有AWC神经元缺陷的线虫总种群中dauer幼虫显著减少，但并未改变突变体线虫的生长。总的来说，研究破译了AWC化学感应在识别沙门氏菌菌株和调节线虫发育可塑性中的显著参与。这项研究将有助于说明我们在沙门氏菌发病机制和宿主反应领域的知识，其中研究团队推测fepB基因对沙门氏菌发病机制的负向调节。生物体的行为和代谢变化是众所周知的可塑性形式，可以承受恶劣的环境条件。病原体也作为压力促进剂，用于在线虫中诱导dauer幼虫。然而，一些问题仍然需要解决，研究团队未能在当前研究中回答，需要进一步研究以了解在突变感染期间，是FepB蛋白（直接或间接）还是其他细菌分泌分子参与改变线虫的可塑性，与WT-STM相比，这些分子受到检查。此外，检测fepB突变沙门氏菌菌株分泌的挥发性气味可能是观察分子重要性以帮助线虫中AWC介导的化学感应的一个重要方面，并理解潜在的感应机制，即AWC神经元是变为AWCON还是AWCOFF来识别ΔfepB菌株分泌的气味。