亚特兰大地区健康宠物与主人间多重耐药肠杆菌传播性的前瞻性研究：基因组学证据与“One Health”视角

本项前瞻性观察性研究通过长达6个月的纵向采样与全基因组测序（WGS）分析，系统探讨了健康人群与伴侣动物（犬/猫）间多重耐药革兰阴性菌（MDR-GNB）的定植与传播动态。研究未发现人与宠物间存在克隆传播或质粒水平基因转移（HGT）的证据，强调细菌定植具有宿主特异性。该研究为理解抗菌药物耐药性（AMR）传播机制提供了重要数据，对制定针对性感染控制策略具有指导意义。

　　

ABSTRACT

抗菌药物耐药性（AMR）是全球关注的公共卫生问题，伴侣动物与人类密切接触可能成为细菌和移动遗传元件传播的潜在途径。这项前瞻性观察性试点研究旨在评估亚特兰大地区健康个体及其伴侣动物（犬和猫）中多重耐药革兰阴性菌（MDR-GNB）的定植流行情况，并探究肠道MDR-GNB的传播动态。研究在6个月内（0、2、6个月）收集并分析了配对人类与宠物的系列粪便样本。共有34名宠物主人参与，其中26人在所有三个时间点提供了样本。从主人和宠物共收集226份粪便样本。26人中的7人和43只动物中的12只携带MDR-GNB，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）和巴氏柠檬酸杆菌（Citrobacter pasteurii）等物种。全基因组测序显示宠物来源的E. coli分离株中存在9种不同的耐药基因，人类来源的分离株中存在8种，同时鉴定出6种不同的质粒复制子，所有菌株分布于4个不同的系统群。系统发育分析表明菌株按宿主物种特异性聚类。研究结果表明，尽管该亚特兰大人群中人和宠物均存在MDR肠杆菌目，但在研究期间未发现宠物与主人间细菌传播的证据。这一发现与先前显示MDR细菌可传播的研究相矛盾，但与认为细菌定植取决于菌株和宿主的研究一致。

IMPORTANCE

动物（尤其是宠物）中的抗菌药物耐药性可能是AMR的潜在来源。然而，人与宠物间克隆细菌传播或水平基因转移的确切途径尚未明确。本试点研究评估了亚特兰大地区健康人群与伴侣动物间MDR肠杆菌目传播的风险，并探究了家庭内MDR细菌定植与传播的关联。尽管未明确传播机制，研究发现该人群虽存在MDR肠杆菌目，但无宠物与主人间传播的证据。

INTRODUCTION

抗菌药物耐药性（AMR）细菌是对人类和动物健康的严重全球威胁，导致全球多种物种的高发病率和高死亡率。即使天然存在于健康个体的肠道微生物群中，多重耐药肠杆菌目（MDR-E）也是兽医和人类医院获得性感染的重要因素，导致发病率、死亡率和医疗成本增加。解决AMR需要医学、兽医、生态学和公共卫生专家协调全面的方法。大多数AMR病原菌属于肠杆菌目，其中肠杆菌科对全球人和动物的健康影响最为显著，主要病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和小肠结肠炎耶尔森菌。产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌目（ESBL-E）和碳青霉烯类耐药肠杆菌目（CRE）菌株已在多种动物群体中被鉴定为肠道共生和致病菌，包括牛、猪和鸡。野生鸟类和环境（如淡水和土壤）可能促进MDR-E传播，进一步引起关注。人们获得AMR细菌的途径多样，包括处理和食用污染食物、直接接触食品生产动物或动物粪便，或通过医院或社区获得性感染暴露。然而，当前研究表明传播并非如先前认为的直接。环境中ESBL细菌的共生储存库近年来急剧增加，由人与动物群体间ESBL-E的传播驱动，可通过多种直接和间接传播途径发生。毒力和耐药基因主要通过水平基因转移（HGT）在细菌间共享，移动遗传元件是DNA传播的主要载体。其他机制，如补偿性或适应性突变，也有助于维持宿主防御系统，包括毒力和耐药基因，以适应和持续存在于竞争性和挑战性环境，包括新的生态位。关于伴侣动物中AMR流行率及其作为耐药菌储存库的潜力知之甚少，这是一个重要问题，因为超过45%的美国家庭养有犬或猫。伴侣动物研究显示健康犬猫粪便中存在ESBL-E定植的证据。伴侣动物中由MDR肠杆菌目引起的感染日益被诊断，通常发生在治疗失败和尿路、耳朵、皮肤、手术部位和呼吸道等区域反复感染之后。此外，已有家庭内ESBL-E在人与宠物犬间传播的证据报道，表明伴侣动物与主人间似乎发生耐药病原体传播。伴侣动物作为耐药细菌感染储存库的作用可能是感染控制的关键方面。人与动物之间的纽带独特，因为人类为宠物创造拟人化环境，使我们本能地认为耐药菌和基因可在人与动物间轻易交换。然而，人与伴侣动物间传播的有效性和确切机制尚未明确确定，传播可能是直接的或间接来自共享食物或环境源的类似暴露。本试点研究旨在确定亚特兰大地区健康人群及其伴侣动物中MDR-GNB定植的流行率，并进一步检验健康人群与其宠物间MDR细菌定植是否存在传播。我们假设宠物主人与其宠物间会发生MDR细菌传播。这项独特新颖的研究前瞻性收集了匹配人类和伴侣动物的系列粪便样本。样本使用选择性培养基分析以分离MDR-GNB，特别是对至少ESBLs、头孢曲松和美罗培南耐药的菌株。分离株通过全基因组测序（WGS）进行表征，以更好地了解美国家庭中这类肠道细菌的定植和传播及潜在健康风险因素。需要综合的“One Health”方法来理解主人与宠物间MDR传播的复杂性。

RESULTS

Sample metadata survey breakdown and prevalence of fecal GNB in pets and their owners

共有34名宠物主人参与本研究，其中26人（女性22人，男性4人）在所有三个时间点提供了粪便样本。参与者中88.5%为白人，7.7%为非洲裔美国人，3.8%为美洲印第安人。参与者年龄范围25至69岁（中位数37岁，平均值43岁）。研究期间，26名参与者中的7人（27%）至少有一个粪便样本在选择性培养基上检测出GNB阳性。43只宠物（犬28只，猫15只）在所有三个时间点提供了样本。28只宠物（65%）为雄性。宠物年龄范围4个月至13岁（中位数7岁，平均值7岁）。宠物睡眠安排和饮食多样，67%与主人同床睡眠，95%定期食用干粮，40%定期食用湿粮，9%定期食用生食。大多数宠物已绝育（94%），98%主要室内生活。三分之一宠物（33%）有慢性兽医问题史，需要更频繁就诊或长期用药。此外，三个参与家庭饲养非犬猫宠物（太阳锥尾鹦鹉、豚鼠和鬃狮蜥），未纳入本研究。最初入选54只宠物，11只因前述原因被排除。总体而言，15只宠物（35%）在研究期间至少有一个粪便样本检测出GNB阳性。描述性数据和GNB定植流行率见表1。未发现阳性宠物与阳性人类主体间存在显著关联（P = 0.19）。根据表1描述特征计算了优势比（表2），无一在P = 0.05水平上显著。

Selective lab-late ID, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight, and WGS GNB species identification

从34名宠物主人及其宠物共获得226份粪便样本。其中33份（15%）在Chrome ESBL琼脂上生长阳性，仅6份在Chrome MacConkey CRE上生长。实验室表型鉴定通过实验室平板ID和基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）显示29株大肠杆菌、5株肺炎克雷伯菌、1株阴沟肠杆菌/阿氏肠杆菌和1株铜绿假单胞菌。22株选定菌株的WGS分析在多数情况下证实了实验室平板ID和MALDI-TOF的表型鉴定。两种方法均确定动物和宠物主人中最常见分离菌为大肠杆菌。其他分离株包括宠物中发现的霍氏肠杆菌和人类中发现的巴氏柠檬酸杆菌和路德维希肠杆菌。总共21株分离株显示表型抗菌药物耐药性和/或通过STREK PCR携带耐药基因。8株分离株通过纸片扩散显示对17种不同抗生素的多重耐药。由于COVID-19大流行期间实验室消耗品短缺，仅完成13株分离株的抗菌药物敏感性试验。

Genomic characterization of AMR E. coli isolated from pet owners and their animals

通过多位点序列分型（MLST）分析进一步分类大肠杆菌分离株，基于七个看家基因：adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA。19株大肠杆菌分离株中鉴定出9种不同ST。宠物大肠杆菌MLST结果包括ST1196、ST1131和ST191各一株，ST372观察到三株。宠物主人中，ST38和ST895各一株，ST69和ST297各两株，肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）ST131在五株不同人类分离株中鉴定。两例人类和两例宠物携带的大肠杆菌未能分配ST。此外，Clermont等2000年开发的计算机大肠杆菌系统分型系统将本研究19株大肠杆菌置于系统群B1、B2、D或F。人类和动物均携带系统群B1菌株，但宠物分离的大多数大肠杆菌菌株（8犬1猫）属于系统群B1。系统群B2是本样本集中最流行，仅发现于宠物主人，其次是系统群D。样本EC_322T0_P9是唯一归类于系统群F的分离株，这是一个新近的大肠杆菌系统群。包含所有时间点所有回收大肠杆菌分离株的核心基因组系统发育分析可视化于图1。祖先大肠杆菌K-12作为外群包含。分离株簇表明宿主物种特异性，具有三个主要分支和八个亚支，与Clermont系统群一致，并清晰按宿主分离大肠杆菌分离株。在此分析中，分离株EC_322T0_P9再次作为单例出现，进一步系统发育分析显示其与所谓大肠杆菌“隐性分支”的亲缘关系比本研究其他任何分离株都更近。在宠物中发现9种不同耐药基因，人类中发现8种，15株不同分离株在质粒上携带耐药基因。仅耐药AMR基因bla-TEM-1B和三个点突变（gyrA两个，parC一个）由动物和人类分离的细菌共同携带，其中bla-TEM-1B位于染色体和质粒上。具体而言，染色体点突变gyrA (D87N)、gyrA (S83L)和parC (S80I)由宠物大肠杆菌EC_304T2_P4和人类大肠杆菌EC_313T0_H5共享，点突变gyrA (S83L)在人类大肠杆菌EC_322T2_H2和宠物EC_322T2_H6中鉴定。总共鉴定出六种不同质粒复制子类型。仅在宠物中发现的质粒类型包括在三只宠物中发现的IncFII(pHN7A8)，以及IncFII、IncR和IncX1，各由不同动物携带。仅人类中单独发现的质粒包括IncFII(pRSB107)型。未发现动物与主人间共享质粒。然而，在非同一家庭的宠物和人类中发现了Several质粒类型，包括IncFIA、IncFII (26)、IncI1-I(Alpha)和Col156。

DISCUSSION

当前文献未详细说明人与宠物间克隆细菌和/或HGT传播的清晰路径。需要进一步研究家庭内人与宠物间MDR-E传播和获得的动态，以指导和定制感染控制实践。本试点研究检验了亚特兰大地区人类和宠物中GNB定植的流行率，揭示了健康无症状个体和宠物粪便中MDR-E定植，这些个体无近期抗生素使用史。具体而言，在此队列中，27%宠物主人（22女4男）、29%犬和7%猫粪便中含有MDR-E。类似研究显示了人类和动物中AMR携带。在一项研究中，评估171只健康宠物（猫和狗）以确定粪便携带大肠杆菌ESBL菌株的比率，发现11.7%携带产ESBL大肠杆菌。犬比其他伴侣动物更可能携带产ESBL大肠杆菌，作为机会性感染的ESBL储存库呈现更大风险。这可能产生深远 outcomes，因为这些MDR潜在病原体的存在可能增加机会性感染风险。令人惊讶的是，我们未发现携带MDR肠杆菌目的宠物与MDR-E阳性主人间存在关联。在我们的选择性收集方法下，大肠杆菌是从粪便中分离出的最流行细菌。此外，我们能够从宠物和人类中随时间检测到相同大肠杆菌菌株。这可能表明宿主在研究期间具有稳定的微生物组。其他物种，如霍氏肠杆菌、路德维希肠杆菌和巴氏柠檬酸杆菌，零星出现，尽管它们是动物和人类肠道微生物群的天然共生菌，具有引起人类医院获得性感染的潜力。我们研究中使用的MALDI-TOF和WGS物种鉴定方法存在 discrepancies。在本研究中，使用MALDI-TOF进行物种鉴定，在某些情况下产生矛盾结果。WGS证实了物种鉴定。尽管两种技术在多数细菌物种鉴定上一致，但MALDI-TOF将一路德维希肠杆菌样本误分类为柠檬酸杆菌属。WGS价格下降和进展鼓励许多兽医诊断实验室探索使用该技术进行微生物鉴定的想法。这支持了先前认为WGS比MALDI-TOF更准确鉴定细菌的发现，特别是在区分密切 related物种或检测新颖或罕见病原体时。表型抗菌药物敏感性试验方法相当准确、简单执行、 inexpensive，并继续在临床实验室中有价值和相关。然而，尽管被称为“金标准”，可能无法及时收到明确结果以开始患者治疗。本研究在COVID-19高峰期进行，阻碍了表型敏感性试验的完成。尽管如此，八株MDR分离株在青霉素类和头孢菌素类抗生素类别上与WGS分析的基因型结果匹配。然而，有一株分离株对美罗培南表型耐药但无WGS确定的相应基因型。这种 discrepancy 在其他研究中已被注意到。尽管有此个别结果，WGS仍为鉴定、控制细菌感染和流行病学应用提供更精确结果。大肠杆菌成为我们研究的焦点，因为它是供体粪便中 consistently发现的唯一MDR-E物种。系统发育分析揭示了清晰分离人类和宠物的 distinct分支，突出了分离株的物种特异性 nature。我们假设人类与宠物间物种特异性聚类发生 due to其微生物组和饮食差异。我们的基因分型研究显示，宠物和主人中分离的大多数大肠杆菌属于系统群B1、B2和D。系统群B2是我们样本集中最流行且主要发现于人类，与先前工作一致。事实上，全球最常见人类ExPEC菌株是ST131，并在我们样本集中鉴定。宠物大肠杆菌中最常见ST是ST372和ST297。与我们研究类似，其他犬大肠杆菌研究主要鉴定属于已知系统群B1的菌株，包括STs 191、297、372和1196。这些菌株是正常犬微生物组的一部分，也被认为是机会性病原体，通常与人类和动物的肠外感染相关。分离株EC_322T0_P9在我们树中作为单例出现，与大肠杆菌隐性分支具有高遗传相似性。大肠杆菌隐性分支是大肠杆菌属内的独特谱系，与典型大肠杆菌菌株密切 related但遗传和表型特征不同。此单一隐性大肠杆菌具有公共卫生相关性，因为它通过标准实验室程序与大肠杆菌无法区分。隐性分支可在环境内繁盛并作为共生和/或致病菌；因此，研究主要 focused on这些隐性分支在各种环境和宿主中的存在，如牲畜和禽类物种。然而，它们与犬宿主的关联尚未被很好理解。宠物322T0_P9食用生食。因此，我们假设这可能是该菌株引入动物的途径。生食继续存在争议，因为生肉饮食的人畜共患成分和对人类健康的危险引起公共卫生官员关注。兽医正在持续进行教育客户和提高意识的努力。人与动物之间的关系和纽带可能 deeply affectionate、友好和亲密。虽然先前研究表明伴侣动物拥有与人类共享的耐药基因和细菌，但可能存在 enable定植的替代暴露途径，如生食。尽管检测到其他肠杆菌目物种，但每种仅发现单一分离株，阻止了有意义比较；因此，大肠杆菌成为唯一进一步表征的细菌物种。本试点研究未显示宠物主人与其动物间MDR大肠杆菌传播。不同家庭的人 colonized with不同菌株大肠杆菌。然而，不同家庭存在的菌株中存在共享AMR基因和质粒，表明暴露来源不同和/或质粒中通过HGT共享基因。此结果不同于其他研究。研究存在一些局限性，包括使用Illumina生成的短读长序列，由于其大小性质提供有限质粒分析。随后，短读长通常无法完成完整质粒组装。质粒基因组中的冗余是常见情况，可能引入组装歧义和片段组装。长读长测序是鉴定质粒的更合适方法，因为它可以准确解析重复区域、检测倒位和 uncover序列内其他大规模结构异常。一些质粒在同一序列内包含多个复制子，为流行病学目的创建有限分辨率。 few研究纵向检验了人类与其伴侣动物间MDR细菌传播。相对较小的样本量限制了进一步分析的能力，便利抽样方法 alongside地理、种族和健康状况多样性不足影响了结果的普遍性。此外，女性宠物主人的参与比例较高，使我们质疑人际关系是否与男性宠物主人不同。人和宠物正常微生物组中鉴定的MDR大肠杆菌在研究期间保持稳定定植，通过研究时间内一致表征结果证明。我们的研究还提出了人类和伴侣动物微生物组是否提供抗感染和病原菌保护屏障的问题，具有潜在饮食影响。此外，不同大肠杆菌菌株仅定植人类或宠物。不同微生物组可能影响细菌存在和耐药性转移潜力。伴侣动物与主人的营养来源非常不同，人们有不同饮食，所有这些都对其微生物组具有 clear implications。这些微生物组 variations确定细菌（肠杆菌目、大肠杆菌）定植、脱落和AMR转移，这可能是我研究中的情况。关于宠物所有权和生食的“One Health”影响强化了未解问题和更深入理解AMR基因和质粒在人类和动物微生物组中 play的潜在力量。此外，室外环境影响显著 contribute to多宿主暴露于MDR细菌 cannot被忽略。本研究中遇到的AMR基因、质粒、STs和系统群的多样性对生物多样性保护、农业和公共卫生具有 implications。

MATERIALS AND METHODS

Study design

参与者从2018年7月至2019年12月期间从亚特兰大地区社区招募。如果年龄超过18岁、总体健康状况良好、MDR细菌定植风险低且家庭中至少有一只伴侣动物（猫或狗），则符合筛选条件。如果参与者有任何MDR细菌感染史、过去一年内曾前往流行ESBL地区（包括东南亚、东地中海或西太平洋）、过去一年内住院超过24小时（不包括分娩）或过去6个月内服用过任何全身性抗生素，则被排除。最后，如果任何其他家庭成员在过去一年内住院超过24小时或过去一年内曾前往流行ESBL地区，参与者也被排除。参与者还被排除如果家庭中任何伴侣动物有MDR细菌感染史、过去6个月内被处方全身性抗生素，或过去一年内在兽医医院住院超过24小时。在初始入组访视期间，收集了参与者和其宠物的详细人口统计学数据、医学史、药物和社会史。针对伴侣动物的目标兽医史，包括信号ment（年龄、性别）、动物品种、最近兽医就诊日期或过去一年内兽医住院情况以及过去30天内任何药物，被记录。还进行了关于犬和/或猫所有权的详细社会史。具体而言，审查了参与者与伴侣同居的细节，重点获取动物居住和度过大部分时间的地点（室内与室外）、动物睡眠地点（即板条箱内与床上与参与者一起）、动物主要饮食（即生商业宠物食品与非生商业宠物食品与共享人类食品）以及家庭中谁是伴侣动物的主要照顾者（受试者与家庭其他成员）。还记录了家庭中所有额外宠物（非猫狗）。在2个月和6个月进行了随访访视和粪便收集。审查和更新了参与者、伴侣动物医学和社会史，特别关注MDR定植风险因素，包括医生或兽医就诊、住院、抗生素使用和旅行。研究流程和采样策略见图3。

Stool collection and bacterial culture

所有参与者均提供了书面说明“ARCA研究粪便收集指南”，关于如何在家收集粪便样本并在访视时提交至实验室。使用10 μL接种环，获取一环粪便并置于脑心浸液（BHI）肉汤中，37°C过夜富集。第二环原始粪便置于冷冻管中，-80°C冷冻作为备份。琼脂平板按指示购买预倾注自制造商，并在使用前储存于4°C。然后取出并接种粪便样本，随后35^o ± 2°C过夜孵育。第2天，将富集肉汤划线接种于带有碳青霉烯类纸片（10 μg美罗培南）和头孢菌素类纸片（30 μg头孢曲松）的MacConkey琼脂以及HardyChrom ESBL琼脂上，按制造商说明进行。从不同培养基回收的分离良好菌落生长于BHI肉汤中，并用15%甘油和蛋白胨水稀释，-80°C储存供后续DNA提取。

Isolate molecular characterization

如果仅在ESBL平板上或MacConkey平板抑制圈内观察到生长，则使用参考方案进行qPCR。使用β-内酰胺酶和ampC基因检测的引物和探针制备按制造商说明进行，使用β-内酰胺酶和ampC Streck ARM-D试剂盒。