人巨细胞病毒（HCMV）感染通过破坏神经元微管组织诱导神经突回缩——微管稳定剂帕利他赛的潜在神经保护作用

本刊推荐：本研究利用人多能干细胞（iPSC）分化的前脑神经元模型，揭示人巨细胞病毒（HCMV）感染通过下调微管相关蛋白（MAPs）破坏微管（MT）稳定性，导致神经突回缩及合胞体形成。微管稳定剂帕利他赛（Paclitaxel）可部分恢复神经突长度并改变合胞体形态，但不影响病毒复制，为干预HCMV所致神经损伤提供了新策略。

　　

人巨细胞病毒（HCMV）感染终末分化神经元破坏微管组织导致神经突回缩

引言

人巨细胞病毒（HCMV）是一种广泛存在的β-疱疹病毒，全球40%–90%的成年人感染该病毒。虽然成人感染通常无症状，但先天性感染可导致严重的神经系统症状，包括听力损失、视觉缺陷、认知障碍和小头畸形，发生率约为10%–15%。HCMV可感染多种神经细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞以及神经祖细胞（NPCs）。近年来，研究证实终末分化的神经元同样易感HCMV，感染后可改变钙信号传导并减少动作电位产生，但感染如何影响神经元结构尚不清楚。

神经元细胞骨架由三种主要元素组成：肌动蛋白微丝、神经丝和微管（microtubules）。微管是由α和β微管蛋白异源二聚体组成的中空极性圆柱结构，其功能受到微管相关蛋白（MAPs）如Tau和MAP2的调节。微管在神经元中形成细胞内“高速公路”系统，通过动力蛋白（dynein）和驱动蛋白（kinesin）介导细胞器、突触囊泡和线粒体的运输，对维持神经元形态和功能至关重要。

结果

HCMV感染改变神经突长度、微管蛋白定位及微管相关基因表达

研究使用四个不相关的iPSC系分化为前脑神经元，在分化第51天以感染复数（MOI）为3感染HCMV TB40/E-eGFP病毒。感染7天后（7 dpi），神经元出现明显的形态学改变，包括合胞体形成和神经突视觉变化。通过MAP2染色和神经突追踪分析发现，感染后每个细胞核对应的神经突数量显著减少，神经突长度呈缩短趋势。特别地，当分析长度≥75 μm的长神经突时，感染显著降低了神经突长度，且长神经突的出现频率在感染组中更低。但轴突膨体（varicosities）频率无显著差异，提示HCMV感染并未导致明显的神经退行性变。

通过RT-qPCR评估细胞骨架成分的基因表达，发现感染后β-肌动蛋白（ACTB）转录本在14 dpi时显著下调（41%），而神经丝轻链（NEFL）和中链（NEFM）mRNA在7 dpi时呈非显著下降，重链（NEFH）转录本则在7 dpi和14 dpi分别上调5倍和17倍。神经元特异性βIII微管蛋白（TUBB3）mRNA在7 dpi和14 dpi分别下调49%和62%。然而，蛋白质水平上，ACTB、神经丝68（NF68）和TUJ1的表达在感染后2、4、7和14 dpi均无显著变化，表明HCMV对细胞骨架的结构改变可能不涉及这些结构蛋白表达水平的改变。

进一步评估微管相关蛋白基因MAPT和MAP2，发现MAPT转录本在7 dpi和14 dpi分别下调48%和62%，MAP2转录本在7 dpi和14 dpi分别下调72%和53%。Western blot分析显示，总Tau蛋白（MAPT编码）在7 dpi和14 dpi分别下调24%和50%，MAP2蛋白在14 dpi时轻微下调18%。这些数据表明，HCMV感染通过下调MAP表达影响微管稳定性。

免疫荧光显示，感染后2、4和7 dpi，与eGFP标记的感染细胞体相关的神经突增厚，TUJ1染色在合胞体核心呈现非丝状 punctate 信号，感染文化中远离合胞体的区域缺乏神经突过程。这些发现提示，HCMV感染可能通过利用细胞内现有的微管蛋白诱导结构表型，改变微管稳定性而非微管丰度。

用帕利他赛稳定微管可改变合胞体形态

研究使用微管稳定剂帕利他赛（Paclitaxel, Pac）和微管破坏剂秋水仙碱（Colchicine, Col）调控微管动力学。浓度测试显示，20 nM Pac可显著增加轴突膨体形成、减少神经突数量和长度，10 nM Pac仅增加膨体形成，而1 nM和5 nM Pac无显著影响，故选择5 nM Pac进行后续实验。Col处理在10 nM时增加膨体形成，但所有测试浓度均未减少神经突数量，反而意外地增加了神经突长度，因此选择2 nM Col进行后续研究。

神经元在感染HCMV后24小时开始接受Pac（5 nM）、Col（2 nM）或DMSO处理，持续6天至7 dpi收集。Western blot显示，各处理组TUJ1表达无显著差异。免疫荧光分析发现，在mock处理组中，各处理条件对神经突数量和长度无显著影响。在HCMV感染组中，未处理、DMSO处理和Col处理均形成形状和大小相似的合胞体，神经突数量和长度无显著差异。而Pac处理的感染神经元形成更线性组织的合胞体，神经突长度总体呈增加趋势，长度≥75 μm的神经突显著长于其他感染组，且长度与Pac处理的mock组相似。长神经突在Pac处理组中更丰富，且在两个iPSC系中均观察到这一现象。Col处理在感染条件下未增加神经突长度，与对照条件相反。神经突数量未受影响。这些数据表明，微管稳定有助于维持神经突延伸，并可能部分破坏HCMV感染诱导的典型合胞体组织。

调控微管稳定性并不显著改变病毒生产标志物

活细胞成像显示，在感染后的169小时内，Pac或Col处理并未显著改变eGFP表达。7 dpi细胞裂解物的eGFP表达分析以及病毒立即早期蛋白1（IE1）和晚期蛋白pp28的表达均无显著差异。条件培养基中的病毒滴度也未因处理而显著改变，尽管Pac处理组有降低病毒生产的趋势。这些数据表明，HCMV感染诱导的结构变化可通过微管调控处理部分缓解，但不影响病毒生产。

讨论

微管与HCMV感染的关联已有数十年历史，其在病毒进入、衣壳运输、病毒组装和释放过程中的作用在多种细胞模型中得到充分记录。然而，在神经元中，微管的功能和结构截然不同，因此成纤维细胞的研究结果可能不适用于神经元。本研究利用iPSC来源的人前脑神经元，描述了HCMV感染对神经元特异性结构现象的影响，特别是对神经元细胞骨架成分表达的影响，并证明微管稳定可减轻感染诱导的形态学异常。

HCMV感染在感染后7天内诱导显著的神经元形态改变，包括神经突回缩和合胞体形成。神经突损失可能并非由于细胞骨架成分基因表达的改变，因为神经丝、肌动蛋白和微管蛋白水平在蛋白水平上无差异表达，但MAP2和Tau的mRNA和蛋白表达均下降，表明感染诱导的细胞骨架重组可能更涉及微管相关蛋白而非微管亚基表达水平的改变。

使用Pac和Col进行药理学调控，发现微管稳定剂Pac可在一定程度上维持感染神经元的神经突结构，特别表现在 longer neurites 的保留上。这一发现提示，Pac处理在HCMV神经元感染背景下可能具有潜在益处。此外，感染神经元的功能障碍，如钙动力学减少和动作电位生成消除，可能需要进一步研究微管调控处理对这些功能的影响。即使结构的轻微维持也可能改善突触活动，因为神经突结构在神经元信号传导中至关重要。

出乎意料的是，微管调控并未显著破坏病毒生产，病毒蛋白表达和滴度均无显著减少。这可能由于Pac浓度较低或处理时间较短，更高浓度或更长时间的处理可能会减少病毒滴度，但可能以神经元健康为代价。此外，本研究使用的文化系统缺乏脑驻留巨噬细胞（小胶质细胞），这可能改变HCMV感染的影响和药物处理的效果。因此，需要进一步研究免疫系统在HCMV诱导的神经元损伤中的作用。

总之，这些数据表明微管稳定性是HCMV神经元病理的潜在调节因子，可能是治疗干预的新靶点。即使神经突生长的轻微改善也可能对神经元健康、存活和功能产生下游有益影响。