产甲烷古菌中最小SufB2C2复合物作为[4Fe-4S]簇支架的功能与演化研究

本研究发现产甲烷古菌中仅由SufB和SufC组成的最小SUF系统可直接作为[4Fe-4S]簇的组装支架，通过SufC末端的三个保守半胱氨酸配位簇合物，并证明其与含SAM的甲基辅酶M还原酶标记蛋白（MmpX）存在相互作用。该研究揭示了不同于细菌多组分SUF系统的古老机制，为理解厌氧环境中铁硫簇生物合成演化及合成生物学应用提供了重要依据。

　　

引言

铁硫（Fe-S）簇是最古老且通用的无机辅因子，存在于所有生命域中。它们通过氧化还原化学和路易斯酸型催化作用，支持生物能量学、生物合成和遗传调控等多种生化过程。Fe-S簇的生物合成包含两个基本步骤：簇组装和转移。在组装过程中，半胱氨酸脱硫酶（通常是一种依赖磷酸吡哆醛的酶）从游离L-半胱氨酸中提取硫，而生理性铁供体尚不明确。随后，铁和硫在支架蛋白上结合，从头形成新生簇。在转移步骤中，预组装的簇通过ATP依赖的伴侣蛋白直接或通过Fe-S簇载体蛋白间接递送到目标脱辅基蛋白。

负责Fe-S簇生物合成的蛋白质机制因生物和环境条件而异。细菌拥有三种已知机制：NIF、ISC和SUF系统。其中SUF系统在微生物中尤其多样。大肠杆菌（Escherichia coli）SUF操纵子编码六种蛋白质：SufA、SufB、SufC、SufD、SufS和SufE。SufS-SufE复合物作为半胱氨酸脱硫酶，将硫传递给支架复合物。SufB及其同源物SufD各与一个SufC ATP酶结合，形成SufBC₂D复合物，作为[4Fe-4S]簇组装的支架。具体而言，SufB仅在存在SufC的情况下从SufE接受硫，而SufD被认为促进铁进入支架复合物。Fe-S簇被认为由SufB/D异源二聚体界面上的三个保守残基配位：SufB^C405、SufB^E434和SufD^H360。SufC是ABC ATP酶超家族的成员，包含特征性的Walker A和B基序以及ATP结合盒（ABC签名基序）。结构研究表明，SufC上独特的Q环介导与SufB或SufD的相互作用。SufA被认为作为簇载体，将Fe-S簇递送到目标脱辅基蛋白。

产甲烷古菌是严格厌氧微生物，广泛依赖Fe-S簇蛋白进行产甲烷作用和生物合成。例如，海沼甲烷球菌（Methanococcus maripaludis）含有的Fe-S簇数量是好氧培养的大肠杆菌的约15倍。然而，细菌和真核生物中典型的Fe-S簇生物合成系统在古菌中 largely 缺失。只有三种Fe-S簇生物合成蛋白——Nbp35/ApbC/Mrp、SufB和SufC——在所有古菌谱系中几乎都是保守的。在海沼甲烷球菌中，Nbp35/ApbC/Mrp结合一个[4Fe-4S]簇，并可将其转移给脱辅基蛋白。然而，其缺失并不损害生长，表明其作为一种非必需的簇转移蛋白发挥作用。

最近的研究提出，由SufB和SufC组成的SUF样最小系统（SMS）代表了最后共同祖先（LUCAs）中存在的祖先SUF系统。它保留在大多数产甲烷古菌中，并且可能是甲烷球菌目（Methanococcales）和甲烷火菌目（Methanopyrales）中唯一的Fe-S簇生物合成机制。转座子诱变数据表明，sufB（基因座标签：MMP1169）和sufC（基因座标签：MMP1168）在海沼甲烷球菌中可能是必需的。然而，在同样拥有ISC系统的甲烷八叠球菌（Methanosarcina acetivorans）中删除sufCB基因簇并未显示生长缺陷。这项研究对SufB和SufC在产甲烷菌中的体内功能提出了疑问。

材料与方法

本研究使用了海沼甲烷球菌（M. maripaludis）和嗜热甲烷球菌（Methanothermococcus thermolithotrophicus, MTH）两种产甲烷古菌。蛋白质序列比对显示，这两个物种的SufB和SufC蛋白具有74%的同一性。MMP SufB和MTH SufB与大肠杆菌SufB有26%的同一性，与大肠杆菌SufD有30%的同一性。MMP SufC与大肠杆菌SufC有39%的同一性，而MTH SufC与大肠杆菌SufC有38%的同一性。

为了研究复合物形成，我们在海沼甲烷球菌中表达了MMP sufCB操纵子，并异源表达了MTH同源物。虽然MMP SufB和SufC蛋白在大肠杆菌中不溶，但MTH同源物成功表达为可溶性蛋白。通过天然下拉、异源下拉和尺寸排阻色谱（SEC）三种证据支持产甲烷菌中SufB/C复合物的形成。

所有纯化步骤均在无氧条件下进行。通过紫外-可见光谱、铁定量、电子顺磁共振（EPR）光谱和簇转移实验对蛋白质进行了表征。ATP酶活性使用孔雀石绿试剂检测释放的无机磷酸盐（Pi）进行测量。簇转移通过测量大肠杆菌aconitase B（AcnB）催化活性的恢复来监测。

结果

SufB和SufC在产甲烷菌中形成SufB₂C₂复合物

研究表明，来自海沼甲烷球菌和嗜热甲烷球菌的SufB和SufC在体内和体外形成稳定的SufB₂C₂异源四聚体复合物。SEC分析显示，纯化的MTH SufB以约94 ± 6 kDa的主峰洗脱，与SufB二聚体一致（计算单体MW = 46.5 kDa）。MTH SufC在约69 ± 2 kDa处洗脱，与SufC二聚体一致（计算单体MW = 30 kDa）。纯化的MTH SufB/C复合物在约156 ± 8 kDa处洗脱，与SufB₂C₂异源四聚体一致。这些结果共同证明SufB和SufC在产甲烷菌中形成稳定的SufB₂C₂复合物。

SufB₂C₂复合物在海沼甲烷球菌中结合[4Fe-4S]簇

四条证据支持产甲烷菌SufB₂C₂复合物中存在Fe-S簇。(i) 紫外-可见光谱：无氧纯化的MMP SufB₂C₂复合物呈褐色，并在~420 nm处有特征性的宽吸收峰。加入5 mM连二亚硫酸钠（DTH）部分漂白了颜色并降低了吸收。该簇在空气暴露下也不稳定。(ii) 铁定量：化学分析显示，在纯化的MMP SufB₂C₂复合物中，每个蛋白质单体含有1.6 ± 0.3个铁原子。(iii) 电子顺磁共振（EPR）光谱：纯化的MMP SufB₂C₂显示一个位于g = 2.003的微小信号，归因于有机自由基污染物。用5 mM DTH还原后，复合物表现出菱形EPR信号，g_∥ ~2.03和g_⊥ ~1.91，是[4Fe-4S]¹⁺簇（S = ?）的特征。(iv) 与异源表达的MTH SufB₂C₂的比较：从大肠杆菌无氧纯化的MTH SufB₂C₂复合物显示出与MMP SufB₂C₂相似的性质。它呈褐色，每个蛋白质单体含有1.54 ± 0.32个铁原子，并在~420 nm处显示宽的紫外-可见吸收峰。DTH处理同样降低了吸光度。纯化的MTH SufB₂C₂的EPR分析显示g ~ 2.01的信号，与立方[3Fe-4S]¹⁺簇（S = ?）一致，而用5 mM DTH还原的蛋白质显示g_∥ ~2.00和g_⊥ ~1.91的信号，是[4Fe-4S]¹⁺簇（S = ?）的特征。鉴于从其天然宿主纯化的MMP SufB₂C₂复合物仅包含[4Fe-4S]簇，在MTH SufB₂C₂中观察到的[3Fe-4S]簇可能是纯化过程中[4Fe-4S]簇部分降解的结果。

MMP SufB₂C₂复合物可将[4Fe-4S]簇转移至脱辅基aconitase

为了评估MMP SufB₂C₂在Fe-S簇转移中的功能作用，测试了其重建[4Fe-4S]簇依赖性酶大肠杆菌aconitase B（AcnB）的能力。通过测量AcnB催化活性的恢复来监测簇转移。正如预期，纯化的MMP SufB₂C₂和脱辅基AcnB单独都没有可检测的活性。然而，共孵育恢复了AcnB活性，表明从MMP SufB₂C₂到脱辅基AcnB的成功[4Fe-4S]簇转移。这些结果表明SufB₂C₂作为支架，能够在产甲烷菌中组装Fe-S簇并将其递送给目标蛋白。

SufB₂C₂复合物与海沼甲烷球菌中的Fe-S簇蛋白MmpX相互作用

为了研究SufB₂C₂与其他Fe-S簇蛋白之间的潜在相互作用，从其天然宿主海沼甲烷球菌中纯化了FLAG₃-Strep₂标记的产甲烷标志蛋白10（MmpX）。MmpX是一种含Fe-S簇的自由基SAM酶，负责甲基辅酶M还原酶中Arg的翻译后甲基化。SDS-PAGE分析显示SufB和SufC与MmpX共纯化，表明存在物理相互作用。这意味着MMP SufB₂C₂复合物可能作为支架，将[4Fe-4S]簇递送给MmpX，促进其体内成熟。

[4Fe-4S]簇由SufC的三个保守半胱氨酸配位

为了确定负责Fe-S簇配位的氨基酸残基，对MTH SufB和SufC中的保守残基进行了定点诱变。在大肠杆菌SUF系统中，残基SufB^C405、SufB^E434和SufD^H360与Fe-S簇结合有关，而SufB^C254可能参与硫转移。这四个残基在古菌同源物中高度保守。MTH SufB中的相应残基——C175、C318、H346和E347——被标记。此外，在产甲烷菌SufB同源物中存在一个保守的半胱氨酸残基（C145）。值得注意的是，产甲烷菌SufC同源物包含一个高度保守的C末端CX_nCXXC基序（C218、C237和C240）。该基序仅存在于某些细菌和非产甲烷古菌SufC同源物中。

为了评估它们在Fe-S簇结合中的作用，将SufB^C145、SufB^C175、SufB^C318、SufB^H346、SufC^C218、SufC^C237和SufC^C240 individually 突变为Ser。突变蛋白在无氧条件下纯化，并通过紫外-可见和EPR光谱进行表征。三条证据支持Fe-S簇结合在SufC上。(i) SufC单独结合簇，而SufB不结合。纯化的MTH SufC呈褐色，每个单体含有1.67 ± 0.14个铁原子。它显示出与MTH SufB₂C₂复合物相似的紫外-可见和EPR光谱。(ii) SufC突变 abolished Fe-S簇结合和转移。MTH SufC的C218S、C237S和C240S变体失去了褐色和紫外-可见吸光度。这些突变体中的铁含量低于检测限（<0.024 Fe / mol protein）。此外，携带三重SufC突变（C218/237/240S）的MTH SufB₂C₂复合物缺乏紫外-可见和EPR信号，并且不含可检测的铁。该突变复合物也未能激活脱辅基AcnB，表明失去了簇转移能力。(iii) SufB突变不损害Fe-S簇结合和转移。携带四个SufB突变（C145/175/318S, H346S）的MTH SufB₂C₂复合物保留了紫外-可见和EPR信号，并以与野生型复合物相当的水平激活脱辅基AcnB。此外，用八倍摩尔过量的Fe²⁺和S^2-对EDTA处理过的脱辅基MTH SufB*₂C₂进行化学重建，成功恢复了[4Fe-4S]簇，EPR光谱与纯化的复合物相似证实了这一点。这一结果证实SufB中的保守Cys残基对于从头簇组装是非必需的。

collectively，这些结果表明，MTH SufB₂C₂复合物中不稳定且可转移的[4Fe-4S]簇由SufC中的三个保守Cys残基——C218、C237和C240——配位，而SufB中的保守残基对于簇结合和转移是可有可无的。

SufB增强SufC的ATP酶和Fe-S簇转移活性

古菌中的SufC同源物包含ABC ATP酶的三个保守基序：Walker A和B以及ABC签名基序。为了确定MTH SufC是否作为ATP酶发挥作用，使用孔雀石绿 assay 测量了其活性。鉴于嗜热甲烷球菌是一种嗜热菌，除了室温（RT）和37°C外，还在60°C下进行了测定。我们的结果揭示了以下几点。(i) MTH SufC alone exhibits ATPase activity。纯化的MTH SufC在pH 7.5、存在5 mM MgCl₂的条件下，在所有测试温度下具有约6 μM 无机磷酸盐（Pi）形成?min^?1?(μM SufC₂)^?1的比活性。(ii) 与SufB形成复合物 enhances SufC ATPase activity。MTH SufB₂C₂复合物的ATP酶活性随温度升高而增加，在60°C时比SufC alone高约7倍。(iii) Fe-S簇的存在不影响ATP酶活性。在MTH SufC或SufB₂C₂复合物的脱辅基和全酶形式之间未观察到ATP酶活性的显著差异。

尽管在SufB上未检测到Fe-S簇，但它们的存在增强了Fe-S簇转移活性。具体而言，MTH SufB₂C₂复合物激活脱辅基AcnB的速率大约是MTH SufC alone的两倍。在携带MTH SufB₂^{C145/175/318S, H346S}C₂突变复合物中也观察到这种增强，表明该效应与SufB中的保守半胱氨酸无关。这些结果表明SufB可能诱导SufC二聚体的构象变化，从而增强其ATP酶活性和转移Fe-S簇的能力。

讨论

Fe-S簇是参与多种细胞过程（包括电子传输、酶催化和基因调控）的必需辅因子。在本研究中，我们表征了来自产甲烷古菌的SufB?C?复合物，并证明了其作为Fe-S簇组装和转移功能支架的作用。我们的研究结果表明，来自海沼甲烷球菌和嗜热甲烷球菌的SufB和SufC在体内和体外形成稳定的异源四聚体复合物SufB?C?。该复合物结合一个[4Fe-4S]簇，这通过紫外-可见光谱、EPR分析和铁定量得到证实。重要的是，该簇是不稳定且可转移的，并且该复合物可以激活大肠杆菌aconitase B（AcnB）的脱辅基形式，证实了其在Fe-S簇递送中的功能作用。

SufB?C?复合物与MmpX（一种参与产甲烷作用的自由基SAM酶）的相互作用表明其在Fe-S簇依赖性酶成熟中的生理作用。这支持了古菌SUF系统在功能上整合到产甲烷菌独有的核心代谢途径中，并可能直接将Fe-S簇转移给目标蛋白的观点。

产甲烷菌SufC的一个显著特征是存在一个保守的C末端CX_nCXXC基序，该基序在细菌和非产甲烷古菌同源物中 largely 缺失。通过突变分析，我们确定了该基序中的三个半胱氨酸对于Fe-S簇配位和转移至关重要。这一结果与最近一篇关于詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）SMS的2025年出版物一致，该出版物通过冷冻电镜分析证明，与大肠杆菌SufC具有32%序列同一性的SmsC通过三个C末端半胱氨酸残基结合[4Fe-4S]簇，而这些残基在大肠杆菌SufC中不存在。我们进一步表明，SufB保守半胱氨酸和组氨酸残基的突变对簇结合和转移没有显著影响。这些结果表明，与大肠杆菌SUF系统中SufB和SufD都参与簇配位不同，产甲烷菌SufC alone作为主要的簇结合组件。这突出了产甲烷古菌中SUF系统的一个独特特征。

有趣的是，尽管SufB不直接结合Fe-S簇，但其存在显著增强了SufC的ATP酶活性和簇转移效率。这种增强与SufB的保守半胱氨酸残基无关，表明其具有结构或变构作用。我们提出SufB结合诱导SufC二聚体的构象变化，增加了Fe-S簇的可及性，并促进了其向目标蛋白的转移。这与之前细菌系统中的研究一致，表明SufB和SufD通过复合物形成调节SufC活性。

从进化角度来看，我们的研究结果表明，产甲烷古菌中的最小SUF系统在其天然宿主中具有活性，并代表了Fe-S簇生物合成的祖先形式。系统发育分析表明，sufB和sufC样基因存在于LUCAs中，并保留在许多现存的古菌谱系中。细菌SUF系统（与其古菌对应物在系统发育上不同）通常包括额外的蛋白质（例如，大肠杆菌中的SufABCDSE或枯草芽孢杆菌中的SufBCDSTU），它们协调硫动员、簇组装和递送。相比之下，严格厌氧的产甲烷菌仅拥有两种SUF组件——SufB和SufC——却保留了Fe-S簇组装和转移的完整功能。我们之前的研究表明，甲烷球菌使用硫化物而不是半胱氨酸和半胱氨酸脱硫酶作为Fe-S簇生物合成的硫源。我们这里的发现显示了SufC独立配位和转移Fe-S簇的能力，SufB作为调节伙伴，进一步将产甲烷菌SUF系统与细菌中的系统区分开来。 collectively，这些观察结果支持了这样的假设：甲烷球菌的双蛋白SUF系统代表了一种古老的Fe-S簇生物合成形式，其历史早于大氧化事件（约24亿年前），当时亚铁和硫化物丰富，氧化应激最小。SUF系统后来的扩展可能是为了应对O₂水平的升高，需要更复杂和保护性的Fe-S簇组装机制，例如，用于硫转移的SufS-E和用于铁获取的SufD。因此，甲烷球菌SufB?C?复合物不仅提供了对Fe-S簇生物发生的机制见解，而且为了解这一基本细胞过程的进化历史提供了一个窗口。

致谢

我们要感谢Louisiana State University的Huangen Ding博士对这项工作的建议和意见。

这项工作得到了Louisiana State University（D.J.V.和Y.L.）以及NSF拨款（MCB-1632941 to Y.L.和W.B.W.）的支持。EPR实验得到了美国能源部科学办公室基础能源科学司化学科学、地球科学和生物科学司光合系统通过拨款DE-SC0025359的支持。