与猪呼吸及腹泻疾病相关的新型猪圆环病毒5型（PCV5）的鉴定、生化特性及流行特征分析

本刊推荐：本研究首次鉴定并命名了一种新型猪源圆环病毒（PCESS DNA病毒）——PCV5，其Rep/Cap蛋白序列同源性显著区别于已知PCV1-4型（最高仅26.2%/20.8%）。通过建立体外培养体系成功分离病毒，证实其直径约20 nm且可形成病毒样颗粒（VLPs）。流行病学调查显示PCV5在中国南方猪场阳性率达24.3%（17/70），血清抗体阳性率66.84%（524/784），且病毒载量与疾病严重程度呈正相关，为圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控提供了新靶点。

　　

引言

真核环状Rep编码单链DNA（CRESS DNA）病毒具有基因组多样性高的特点。在猪中已鉴定出圆环病毒属（Circovirus）的四个物种，包括非致病性的猪圆环病毒1型（PCV1）和致病性的PCV2、PCV3、PCV4。本研究从患呼吸系统疾病、腹泻及繁殖障碍的猪群中鉴定出一种新型单链环状DNA病毒，其Rep和Cap蛋白的氨基酸序列与已知四种PCV同源性极低（Rep与PCV2最高同源性26.2%，Cap与PCV4最高同源性20.8%）。由于CRESS DNA病毒分类主要依赖Rep蛋白，生化分析证实该病毒Rep具备典型CRESS DNA病毒特征，故暂命名为猪圆环病毒5型（PCV5）。该命名反映了其宿主来源和基因组结构特征，但系统发育分析表明其不属于圆环病毒科（Circoviridae），而与海豹粪便相关环状DNA病毒（FSfaCV）亲缘最近。

流行病学调查

通过基于GenBank宏基因组序列设计的通用引物，2021年10月至2023年6月期间，在17个出现呼吸系统疾病、腹泻及繁殖障碍的猪场中检测到PCV5感染。PCV5在猪场中的阳性率为24.3%（17/70），表明其在中国南方地区广泛流行（图1A）。但当前数据尚未揭示其传播动态和流行病学特征，需进一步研究不同区域和季节的流行规律。

基因组特征与遗传分析

通过PCR和Sanger测序，从仔猪肠道 homogenate中组装出全长2,904 nt的环状基因组（图1B）。PCV5基因组包含两个超过300个氨基酸的开放阅读框（ORFs），经BLASTP比对和结构预测证实为Rep（1,056 nt）和Cap（1,182 nt）蛋白，其茎环结构（stem: 9 nt, loop: 17 nt）显著长于PCV1-4及已知人类圆环病毒（表S1）。

Rep蛋白序列比对显示，PCV5与PCV1-4、猪圆环样病毒（PCLV）及人类CRESS DNA病毒的Rep同源性均低于26.2%（图2A）。12株PCV5毒株间Rep同源性为87.7%-99.7%，与FSfaCV（登录号KF246569.1）同源性为85.8%-92.6%。Cap蛋白序列同样呈现低同源性（<20.8%），与FSfaCV同源性为89.1%-99.2%（图2B），证实PCV5为新型环状DNA病毒。

Rep蛋白生化特性

通过AlphaFold2预测PCV5 Rep结构，发现其与PCV2 Rep（PDB: 5XOR, 7IAR）类似，具有典型的三结构域：N端内切核酸酶结构域、寡聚化结构域和超家族解旋酶/ATP酶结构域（图3A）。尽管序列同源性低，CRESS DNA病毒的Rep结构高度保守。

全长PCV5 Rep在大肠杆菌中以包涵体形式表达（图3B）。截断N端内切核酸酶结构域（PCV5 Rep NΔ118）后可溶性表达（图3C），尺寸排阻色谱显示其以寡聚体形式存在（图3D）。孔雀石绿磷酸盐比色法检测证实PCV5 Rep NΔ118具有ATP酶活性，酶动力学数据符合米氏方程（图3E）。免疫荧光显示Rep主要定位于细胞质，少量进入细胞核（图S2A）。这些生化特征支持PCV5属于CRESS DNA病毒。

系统发育分析

基于49个CRESS DNA病毒家族代表株及12株PCV5 Rep序列构建系统发育树（图4）。PCV5与FSfaCV亲缘最近，而独立于PCV1-4、PCLV及人类CRESS DNA病毒，且基因组长度显著差异，证实其为新型CRESS DNA病毒。

组织病理学关联

通过qPCR检测PCV5 Rep基因（图S2-S4），在广西12头仔猪组织样本中均检测到高病毒载量（CT值11.1-34）（表1）。病毒载量与临床症状严重程度正相关：低病毒载量时，肠道组织、肠系膜淋巴结和粪便中病毒浓度较高；随症状加重，其他器官（包括脑组织）中病毒载量上升，表明病毒可突破血脑屏障。繁殖障碍猪场的死胎样本中也检测到PCV5 DNA。

HE染色显示，随PCV5 CT值降低（仔猪编号01、06、12、07），器官病变程度加剧，以回肠病变最为显著（图5A）。Western blotting使用制备的多克隆抗体在感染猪结肠样本中检测到病毒蛋白（图5B），进一步证实PCV5与组织病变的关联。

病毒分离与形态鉴定

使用马立克病淋巴瘤细胞系（MDCC-MSB1）从仔猪肠道组织中分离PCV5（图6A）。病毒培养未见细胞病变效应（图S5A）。通过不连续蔗糖梯度离心（30%-50%蔗糖浓度）纯化病毒（图6B），SDS-PAGE和Western blotting证实PCV5存在于Band 1（图6C-D）。负染电镜观察到直径约20 nm的无包膜二十面体病毒颗粒（图6E-F），形态符合圆环病毒科特征。连续蔗糖梯度离心（10%-50%）进一步验证病毒形态（图S5B-E）。

PCV5病毒样颗粒组装及血清学应用

PCV5全长Cap无法在大肠杆菌中表达。结构预测显示其Cap与已知CRESS DNA病毒Cap结构高度相似，均为典型果冻卷结构（jelly roll）（图7A）。截断N端63个氨基酸（PCV5 Cap-NΔ63）后可大量表达（图7B），尺寸排阻色谱显示其以寡聚体形式存在（峰体积8-9 mL）（图7C）。电镜观察证实纯化Cap可自组装成17-22 nm的病毒样颗粒（VLPs）（图7D-E）。

基于PCV5 Cap VLPs建立间接ELISA方法，特异性与重复性良好（表S2-S3）。784份猪血清样本中PCV5抗体阳性率为66.84%（524/784），其中广东71.46%（298/417）、广西41.48%（56/135）、湖南69.02%（78/113）、云南77.31%（92/119）（表2）。不同生长阶段猪群抗体阳性率：哺乳仔猪52.63%（30/57）、保育猪51.06%（48/94）、育肥猪65.69%（67/102）、母猪71.37%（379/531）（表3），表明PCV5在中国南方猪群中广泛传播。

讨论

PCV5与FSfaCV高度同源，但宿主差异显著（图8）。Rep蛋白生化特性支持其属于CRESS DNA病毒。病毒载量与疾病严重程度密切关联，体外培养体系成功建立及病毒纯化为其致病机制研究奠定基础。小鼠攻毒实验显示PCV5无法感染小鼠（图S6，表S4），提示其宿主特异性。

CRESS DNA病毒多样性丰富，PCV5的发现扩充了该类病毒库。其跨胎盘屏障和血脑屏障能力、高病毒拷贝数及环状DNA基因组稳定性利于传播。与PCV2/PCV3类似，PCV5可能通过潜伏感染和协同感染机制致病，但PCV5与PCV2/PCV3共感染研究需进一步开展（当前检测方法差异：PCV5主要检测粪便样本，PCV2/PCV3多基于血液检测）。

PCV5在健康猪群中呈低载量亚临床感染，疾病爆发期病毒流行率显著升高，提示其潜在潜伏感染特性及与其他病原协同致病可能性。本研究为PCVAD防控提供了新方向，但PCV5的明确致病机制及与其它病原互作需深入探索。

材料与方法

样本来自华南农业大学国家生猪种业工程技术中心2022年初接收的12头5-20 kg患呼吸系统及腹泻疾病仔猪组织样本。通过实验室保存的检测方法筛查与肠道疾病、呼吸系统疾病及繁殖障碍相关的微生物和病毒。基于Rep基因保守区域设计引物（表S5）进行PCR及qPCR检测。病毒基因组测序数据上传GenBank（表S1）。使用AlphaFold2预测蛋白结构，MDCC-MSB1细胞进行病毒分离，蔗糖梯度离心纯化病毒，负染电镜观察形态。原核表达系统制备重组蛋白，间接免疫荧光和Western blotting分析蛋白定位及表达。兔抗PCV5 Cap多克隆抗体用于血清学检测，VLPs-ELISA方法评估抗体阳性率。