牛肝脓肿病原体溯源新发现：后肠道作为潜在致病菌来源的机制与临床意义

本刊推荐：本研究通过培养与定量PCR（qPCR）技术，系统分析了未使用泰乐菌素（tylosin）的育肥牛肝脓肿（LA）及其匹配瘤胃与结肠上皮组织，首次证实后肠道（hindgut）是坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）亚种的重要来源，并揭示了肝脓肿多微生物（polymicrobial）感染特性，为靶向干预提供了新方向。

　　

引言：牛肝脓肿的经济与健康负担

牛肝脓肿（Liver abscesses, LA）是育肥牛养殖业中的重大经济负担，主要导致肝脏及内脏废弃，更重要的是严重影响牛只生长性能、胴体产量和品质。长期以来，肝脓肿被认为是由瘤胃来源的细菌通过门脉血液转移至肝脏引发的多微生物感染。其中，坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）的两个亚种——坏死梭杆菌亚种（subsp. necrophorum）和基础梭杆菌亚种（subsp. funduliforme）——是最主要的病原体，其次为化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）和肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）。然而，后肠道（hindgut）作为肝脓肿病原体潜在来源的作用尚未被充分探讨。

在高谷物日粮饲养的牛群中，瘤胃酸化和随之而来的瘤胃炎是肝脓肿发生的主要诱因。酸性环境破坏瘤胃上皮屏障，使F. necrophorum和T. pyogenes等病原体侵入血液并最终定植于肝脏。值得注意的是，S. enterica的自然栖息地为后肠道，暗示其后肠道来源的可能性。后肠道（主要为结肠）承担了约5%–10%的全消化道碳水化合物消化功能，未能被瘤胃完全降解的淀粉流入后肠道发酵产酸，可能导致后肠道酸化。与复层鳞状上皮的瘤胃不同，结肠单层柱状上皮更易在酸性环境下发生屏障功能破坏和细菌 translocation。

近年来，基于16S扩增子测序或宏基因组学的培养非依赖研究进一步揭示了肝脓肿细菌群落构成的复杂性。除主导的 Fusobacteriota 门之外，Pseudomonadota 和 Bacteroidota 是另外两个优势菌门，在属水平上，Pseudomonas、Bacteroides 和 Porphyromonas 也被鉴定为优势菌属。这些发现强调了有必要开展针对性的培养研究，以了解较少被关注的细菌物种在肝脓肿形成中的流行情况。

材料与方法：样本收集与病原体检测策略

本研究在联邦检验的牛肉加工厂采集了96头未使用泰乐菌素育肥牛的肝脓肿及匹配的瘤胃和结肠上皮组织样本。样本采集后立即冰藏并连夜送至实验室进行处理。

肝脓肿脓液及上皮组织经过表面灭菌和匀浆后，分别采用培养法和定量PCR（qPCR）进行病原体分析。目标细菌包括：F. necrophorum、T. pyogenes、S. enterica，以及此前未被针对性研究过的大肠杆菌（Escherichia coli, EC）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）。

对于F. necrophorum，使用针对其白细胞毒素基因（lktA）启动子区的qPCR assay以鉴定和定量两个亚种。培养方法则采用包括富集步骤在内的选择性培养基进行目标菌的分离和鉴定。统计分析采用广义线性混合模型处理流行率数据，并用线性混合模型（LMMs）分析细菌浓度数据。

结果：病原体流行率与定量分析

F. necrophorum 在肝脓肿中的流行率与浓度

所有96份肝脓肿样本均检测到F. necrophorum（100%）。亚种necrophorum的培养流行率为86.5%，qPCR为74%；亚种funduliforme的培养流行率为21.9%，qPCR为24%。值得注意的是，78.1%的脓肿仅含有亚种necrophorum。qPCR在经乳酸或赖氨酸富集后检测到更多阳性样本，表明其灵敏度更高。

肝脓肿中F. necrophorum的浓度极高，达到7.0–7.5 log₁₀ CFU/g（菌落形成单位/克），且两亚种在单独或共同存在时浓度相当。这反映了它们在脓肿发展中处于活跃生长状态。

瘤胃与结肠上皮组织中F. necrophorum的流行率

在瘤胃上皮组织中，两亚种的总流行率（qPCR）为90.6%，在结肠中为69.8%。然而，通过培养法，亚种necrophorum在结肠中的分离率（19.8%）显著高于瘤胃（6.3%）。浓度方面，瘤胃组织中Fusobacterium的浓度（4.0–5.5 log₁₀ CFU/g）高于结肠组织（4.5–5.0 log₁₀ CFU/g）。

其他病原体的流行情况

T. pyogenes 在肝脓肿中的培养流行率为35.4%，在瘤胃中为11.5%，在结肠中未分离到。S. enterica 在肝脓肿中的总流行率为6.3%，且均通过富集后分离得到；在瘤胃和结肠中的流行率分别为4.2%和7.3%。

在新检测的病原体中，E. coli 最为突出。其在肝脓肿中的总流行率为70.8%，但绝大多数（64/68）分离株来自富集样本，表明其在脓肿中浓度较低。相反，在瘤胃（92.7%）和结肠（91.6%）上皮中，E. coli 流行率极高且多通过直接分离得到，暗示其在这些组织中可能浓度较高并参与局部感染。K. pneumoniae 和 P. aeruginosa 在肝脓肿中的流行率分别为17.7%和16.6%，且也多通过富集分离。所有样本均未检测到B. fragilis。

共现与溯源分析

亚种necrophorum在瘤胃和结肠中的检出与肝脓肿存在高度共现（分别为83.3%和89.5%），而亚种funduliforme的共现率较低（17.1%和31.2%）。T. pyogenes 仅与瘤胃来源显示高共现（90.9%）。S. enterica 则与后肠道来源显示出关联性。这些数据支持了后肠道是F. necrophorum（特别是亚种necrophorum）和S. enterica的潜在来源。

讨论：多微生物感染与后肠道的新角色

本研究通过综合运用培养和分子技术，再次确认了牛肝脓肿是多微生物感染，其中F. necrophorum subsp. necrophorum是优势病原体。尽管E. coli是第二常见的物种，但其在脓肿中的低浓度（需富集才可检测）表明它可能不是脓肿发展的主要驱动因素，而更可能在瘤胃或结肠中引起局部炎症，破坏上皮完整性，为其他病原体的入侵创造条件。

本研究最重要的发现是揭示了后肠道（结肠）作为肝脓肿病原体，特别是F. necrophorum和S. enterica的潜在来源。结肠上皮中亚种necrophorum的分离率高于瘤胃，且共现分析显示其与肝脓肿有强烈关联，这挑战了传统上认为瘤胃是唯一病原体来源的观点。

这一发现具有重要的实践意义。目前广泛用于预防肝脓肿的抗生素泰乐菌素（tylosin）主要作用于瘤胃，可能无法以活性形式到达后肠道以抑制那里的病原体。这可能是泰乐菌素无法100%预防肝脓肿的原因之一。因此，未来的干预策略可能需要同时针对瘤胃和后肠道。

结论与展望

本研究阐明，牛肝脓肿是由F. necrophorum（尤其是亚种necrophorum）主导的多微生物感染。虽然E. coli等菌种高频出现，但其在脓肿中的低浓度表明其直接致病作用有限。关键的突破性发现是，后肠道是F. necrophorum和S. enterica的一个重要储库，这为理解肝脓肿的发病机制开辟了新视角。

未来的研究需要通过全基因组测序来确认肝脓肿与结肠上皮中F. necrophorum菌株的同源性，并量化后肠道来源对肝脓肿形成的实际贡献。这些工作将有助于开发针对后肠道微生物组的新型干预措施，从而更有效地控制这一 costly 疾病。