基于人群的沙眼衣原体基因型在眼部和泌尿生殖道样本中的一致性研究：瑙鲁的高流行区证据

本研究首次在沙眼衣原体（Ct）眼部和泌尿生殖道感染高流行的瑙鲁开展人群水平基因分型，通过ompA和rg1靶点测序分析，发现儿童眼部感染仅由基因型C（经典沙眼株系）引起，而成人的泌尿生殖道样本中检出D、E、G、J、Ja和L1基因型（泌尿生殖株系），两组样本在系统发育上完全分离，未发现种群水平交叉传播的证据，表明在高度共流行环境下，两类感染仍存在独立的传播网络。

　　

ABSTRACT

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）可引起性传播的泌尿生殖道感染和眼部感染，后者多发生于儿童之间，是致盲性疾病沙眼的病原体。尽管两类感染通常由不同的菌株引起，但有证据表明泌尿生殖道株系可能感染眼部并引起结膜炎，暗示成人或青少年可能通过手指接触将病原传播给儿童。本研究在瑙鲁——一个眼部和泌尿生殖道感染均高流行的地区——开展了首项基于人群的沙眼衣原体基因型分析，旨在明确两类感染之间是否存在交叉传播。

INTRODUCTION

沙眼衣原体是一种可感染眼部、泌尿生殖道和肛门上皮的细菌。沙眼是由眼睑结膜组织对沙眼衣原体眼部感染产生的炎症反应所致。2024年4月，估计有1.03亿人生活在存在沙眼公共卫生问题的地区，幼童最易感染并出现沙眼性炎症—滤泡（TF）的早期临床表现。反复感染可导致长期炎症，进而引起眼睑瘢痕形成、倒睫，损伤角膜并可能导致失明。

沙眼衣原体尿道、宫颈或肛门感染是一种常见的性传播感染，与感染部位的局部炎症相关，对生殖健康结局产生不利影响并增加HIV传播风险。2020年，全球15–49岁人群中有估计1.285亿新发性传播沙眼衣原体感染。某些沙眼衣原体菌株可从生殖道上皮传播至淋巴系统的单核细胞，引起淋巴肉芽肿性性病（LGV）。

沙眼衣原体根据组织水平的解剖定位分为两个生物变种：沙眼生物变种涉及上皮感染，包括眼部和泌尿生殖道菌株；而淋巴肉芽肿性性病生物变种通过淋巴系统全身传播。

沙眼衣原体的基因分型基于外膜蛋白（由ompA基因编码）的序列变异，已定义出19种基因型。与眼部感染和沙眼相关的为ompA基因型A、B、Ba和C；基因型D、Da、E、F、G、Ga、H、I、Ia、J和K通常与泌尿生殖道沙眼衣原体感染（通常简称为衣原体感染）相关；而基因型L1、L2和L3与LGV相关。由D–K基因型引起的沙眼衣原体感染也可发生于眼部，导致与A–C型引起的TF临床无法区分的病症，通常见于并发泌尿生殖道感染者、其性伴侣或家庭接触者。

瑙鲁是位于太平洋中部的一个小型珊瑚岛。根据最新发布的2021年瑙鲁人口与住房普查，总人口为11,680人，分布在2,021户家庭中（平均每户5.8人），中位年龄21.6岁，出生时预期寿命63.9年。2011年至2021年的负净迁移率（?1.0%）是由于基里巴斯和图瓦卢工人的遣返所致，但涉及周边岛国（如基里巴斯共和国和所罗门群岛）的迁移流量数据无法确定，因瑙鲁海关和移民办公室未收集这些数据。此外，还有离岸澳大利亚移民拘留设施收容的寻求庇护者未计入瑙鲁人口。

瑙鲁眼部和泌尿生殖道衣原体感染均高流行。2019年7月的一项全国沙眼基线患病率调查估计，在1-9岁儿童中，TF患病率为22%，眼拭子中沙眼衣原体和毛细血管血中抗沙眼衣原体抗体的阳性率均超过30%。2011年至2015年间，常规收集的泌尿生殖道标本中衣原体感染阳性比例从3.4%稳步上升至13.6%。2020年开展了一项全国家户调查，通过在沙眼阿奇霉素大规模给药（MDA）前后收集和分析尿液标本，估计18–29岁成人泌尿生殖道衣原体和淋病的患病率（论文准备中）。许多太平洋岛国记录到泌尿生殖道衣原体感染高流行，而眼部衣原体感染在基里巴斯检测到高水平，其他太平洋岛国的患病率低得多。

关于泌尿生殖道沙眼衣原体菌株对沙眼样眼病作用的已发表文献迄今仅限于病例报告和病例系列。令人担忧的是，在沙眼和泌尿生殖道衣原体感染负担均高的环境中，可能存在菌株交叉，且地方性泌尿生殖道感染可能促进儿童眼部感染并增加视力丧失风险，或（即使泌尿生殖道菌株未增加长期沙眼后遗症风险）使沙眼消除工作的监测和评估复杂化。因此，我们开展了据信是首项在高流行区对沙眼衣原体眼部和泌尿生殖道菌株交叉进行的人群调查。

MATERIALS AND METHODS

样本收集

眼部标本

在2019年7月全国沙眼调查背景下，从参与研究的1-9岁儿童收集结膜拭子以检测沙眼衣原体。简言之，对于沙眼部分，使用瑙鲁15个行政区域（14个区和1个定居点）创建了20个集群，每个集群人口规模约为560人，另从三个人口最多的区域划分出五个细分区域。每个集群从平均90户中随机抽取约23户，使用现有家户列表，个人资格限于瑙鲁公民。总共检测到277/780份沙眼衣原体阳性拭子（每份来自一名儿童），如前所述，然后储存于?20°C。

尿液标本

在2020年4月阿奇霉素MDA前一周（2020年3–4月）和MDA后8个月（2020年12月）进行了横断面调查，两轮使用相同方法。对于泌尿生殖道调查部分，我们目标为年龄≥18至≤29岁的瑙鲁成人。基线和随访调查均使用随机抽样方法，使用与2019年7月实施的沙眼调查相同的20个集群。对于两项调查，每项随机选择一半集群参与研究。每个集群中，从现有家户列表中随机抽取一半家庭。参与者提供一个无菌尿杯用于采集首段尿（FPU）样本，并要求提供1050 mL样本。研究团队在野外携带标本最多8小时。每天结束时，每个标本分装到COBAS（罗氏诊断，澳大利亚）培养基管中，准备在室温下运输至澳大利亚。

计算同一家庭在两项调查中被抽样的概率，确定每项调查中每个集群的抽样家庭百分比，相乘后跨集群计算最终平均值（数据未显示）。

沙眼衣原体检测

眼拭子和尿液最初使用cobas CT/NG检测（罗氏诊断，澳大利亚）在澳大利亚悉尼St Vincent’s应用医学研究中心进行沙眼衣原体筛查。在收集的尿液标本中，MDA前调查80/369（21.7%）和MDA后调查49/345（14.2%）沙眼衣原体检测阳性，这129份样本储存于?20°C，直至本基因分型研究需要。

沙眼衣原体阳性的去标识化标本冷冻运送至布里斯班UQCCR实验室进行后续遗传特征分析。我们从每份尿液或眼拭子样本的200 μL等分中提取核酸，使用MagNA Pure 96系统（罗氏诊断，新南威尔士，澳大利亚）最终洗脱为50 μL。使用该提取核酸进行聚合酶链反应和Sanger测序。

基因分型：按解剖部位的沙眼衣原体

采用Giffard等人（2018）方法 adapted to a Sanger sequencing approach，对所有样本提取物直接进行沙眼衣原体基因分型。我们最初靶向ofr（覆盖主要外膜蛋白编码基因ompA片段的扩增区域）用于所有样本，并对33份样本额外靶向rg1（沙眼衣原体B_Jali20基因组中由Jali-1891定义的假设基因片段）。尽可能选择代表每种ompA基因型的至少一份样本，使用rg1进行进一步表征。样本通常选择跨Ct值范围，以避免仅偏倚高细菌载量样本。感兴趣的rg1区域包含两个SNP，定义了四种单倍型，与更广泛的沙眼衣原体基因组系统发育一致。对ompA和rg1片段进行测序提供了高组合分辨能力，以：i）区分眼部和泌尿生殖道谱系；ii）区分经典眼部谱系和三种具有泌尿生殖道型基因组背景的非典型澳大利亚眼部谱系；iii）将整个物种区分至其主要进化谱系，全部用于确认解剖部位特异性基因分型。20 μL反应混合物包含10 μL QuantiTect SYBR Green PCR mix（Qiagen），各0.45 μM引物（ofr-F 5′ TCCTACTGCAATACCGCAAG 3′ 和 ofr-R 5′ TGAACCAAGCCTTATGATCG 3′，或 rg1-F 5′ CCC ATT GCC GAG AGA TAA AA 3′ 和 rg1-R 5′ CTC CTG CGG AGG TTA GAT TG 3′），和5.0 μL样本提取物。循环条件包括95°C 15分钟酶活化，以及45个循环的94°C 15秒、60°C 20秒和72°C 60秒；循环在Rotor-Gene Q仪器（Qiagen）上进行。ofr和rg1区域的扩增通过高分辨率熔解测定，该法在检测扩增子方面比凝胶电泳更敏感。选择代表本研究中大多数ompA基因型（C、D、E、G、J和Ja）的样本，进一步用rg1靶标测序以确认基因分型分辨率。一份键入为L1的眼拭子无法使用rg1 assay扩增。ofr（ompA）和rg1的预期扩增子大小分别为1,015 bp和354 bp，并由服务提供商澳大利亚基因组研究机构（布里斯班，澳大利亚）进行双向（正向和反向）Sanger测序。

系统发育分析

为说明沙眼衣原体检测与瑙鲁人群的遗传关系，我们构建了一个无根系统发育树。使用BioEdit序列比对编辑器（版本7.0.5.3）中的ClustalW比对完整的沙眼衣原体ofr序列。使用Geneious Prime（版本2019.2.3）以最大似然算法和Tamura Nei模型生成系统发育树。使用iTOL可视化和注释所得树。

RESULTS

眼部标本

在初始沙眼调查中，272/780（34.9%）参与者拭子PCR检测沙眼衣原体阳性。尽管存在标签错误，仍有五份PCR阳性的额外拭子被发送进行基因分型。使用主要表征靶点ompA的基因分型对107/277（38.6%）眼拭子成功，沙眼衣原体检测的原始C_T值范围19.75至39.56。1015 bp扩增子几乎全部双向测序，眼拭子和尿液样本均获得约900 bp序列。基于ompA（ofr靶标）测序，所有眼部衣原体标本均为基因型C（107/107；100%）。大多数样本，92/107（86.0%），共享100%序列同一性，而15份样本检测到单碱基对变异。为确认基因分型分辨率，15份眼部样本进一步在rg1靶标测序，该靶标也用于确认眼部菌株（GC）属于沙眼生物变种T2谱系中的经典C簇，根据Giffard等人提出的分型方案。

尿液标本

ofr（ompA基因）靶标的Sanger测序对54/80（67.5%）MDA前和41/49（83.7%）MDA后尿液标本成功。阳性沙眼衣原体检测的原始cobas CT/NG assay C_T值范围23.09至34.05。尿液标本产生沙眼衣原体基因型D、E、G、J和Ja，除一份为L1。基因型D最常见（35, 36.8%），其次为E（30, 31.6%）、Ja（16, 16.8%）、G（7, 7.4%）和J（6, 6.3%）。MDA前后检测到相似的基因型模式。18份尿液样本，代表ofr靶标的大多数ompA基因型，进一步进行rg1靶标测序。结合ofr和rg1位点，识别了与常见和罕见UGT基因型（GA, GT）相关的 major different phylogenetic lineages in sampled urine specimens。

代表每种ofr基因型的样本及其配对的rg1组被纳入系统发育，显示根据样本类型（尿液和眼部）的两个位点均存在 distinct grouping。

对于无法使用Sanger测序方法分型的样本，沙眼衣原体检测的原始cobas CT/NG assay C_T值范围，尿液样本为23.07至41.46（34/129, 26.4%），眼部样本为22.7–43.07（170/277, 61.7%）。

DISCUSSION

在瑙鲁，我们完成了据信是首项在同一地方性环境中同时尝试在人群水平对眼部和泌尿生殖道标本进行遗传特征分析的研究。我们的目标是调查种群水平而非个体水平的类型交叉。即使在地方性环境中，同一个体同时发生沙眼衣原体泌尿生殖道和眼部感染也很罕见，因为众所周知泌尿生殖道感染在较大青少年和成人中通过性传播，而眼部感染是儿童中通过同伴间鼻眼分泌物传播的现象。此外，未尝试跨调查链接儿童和成人，因为相关传播事件可能发生在其他地方和过去。我们发现儿童眼部感染可归因于沙眼相关沙眼衣原体的单一血清型（基因型C），而成人的尿液标本中检测到六种不同的泌尿生殖道基因型D、E、G、J、Ja和L1。MDA前后观察到相似的沙眼衣原体基因型模式。

结合的ofr（ompA基因）和rg1测序显示，沙眼衣原体眼部和泌尿生殖道基因型 exclusively grouped according to the anatomical site of collection。MDA前后患者尿液样本中检测到相似的沙眼衣原体泌尿生殖道基因型（D、E、G、J和Ja），表明尽管有抗生素治疗，总体ompA基因型分布保持相对稳定。

眼拭子中可分型的沙眼衣原体分离株在整个研究人群中遗传同质，除15份样本含单核苷酸变异。这与先前澳大利亚北领地结膜样本研究的结果一致。此外，眼拭子中未检测到泌尿生殖道基因型。 together, this evidence indicates that urogenital strains of C. trachomatis are not making a material contribution to eye infections in Nauru。跨调查，同一家庭内参与者被抽样的平均概率为7.2%。观察到的按部位类型分离并不排除交叉可能发生，正如别处病例报告所示，但表明它不太可能是一个重要的公共卫生问题。

我们的研究在短时间内对同一小型高流行沙眼和泌尿生殖道感染人群的两个解剖部位大样本集进行了基因分型。交叉程度尚未很好量化；我们假设在两类感染均高流行的环境中更可能观察到。早期调查泌尿生殖道类型的研究未在泌尿生殖道标本中检测到沙眼基因型或在眼拭子中检测到泌尿生殖道基因型，但未在共流行人群中进行。交叉感染 certainly possible，但在高度共流行人群中没有可检测证据的情况下，我们 suggest that it is a rare event。可能该人群泌尿生殖道和眼部感染的高流行降低了交叉可能性：沙眼衣原体长期感染后 followed by type-specific, partial immunity，且有证据表明可能刺激跨黏膜保护。我们研究中泌尿生殖道标本单次检测到LGV变体L1，凸显了评估该社区中较少见、更具侵袭性淋巴肉芽肿性性病发生的必要性。

我们观察到 high proportion of samples for which we could not produce PCR amplicons suitable for sequencing（202/406, 49.8%），因此无法分型。我们聚焦于ompA基因，尽管作为单拷贝基因，它可能比其他沙眼衣原体基因更难扩增，因为基于ompA的Sanger测序方法在区分密切相关的基因型（如J和亚变体Ja）方面提供最佳分辨率。临床标本的低可分型性是人群水平表征沙眼衣原体基因型分布 recurring challenge。在我们的研究中，它最常发生于具有高C_T（指示低沙眼衣原体载量）的尿液和眼部标本。低细菌载量 consistently reported as a barrier to investigating circulating genotypes from urine samples。通过巢式PCR程序和限制性片段长度多态性（RFLP）方法使用从5 mL尿液制备的尿液沉淀物提取核酸，已实现尿液标本基因分型的高成功率。该策略无法检测混合感染，但允许我们区分临床标本中的主要基因型，以实现遗传监测目标。研究中使用全基因组测序方法的成功可能性也有限， especially if samples are degraded or of low bacterial load（即那些初始Sanger测序失败的样本）。未来的基因组研究可纳入更全面的人群水平基因组学探索，如敏感的agnostic鸟枪法测序方法，以改进对PCR和Sanger测序技术的菌株检测。

据我们所知，这是唯一描述眼部 and urogenital anatomical sites基因型在眼部和非眼部沙眼衣原体感染共流行人群中 contemporaneous distribution 的分型研究。此外，这是唯一已发表的瑙鲁沙眼衣原体ompA基因型研究，也是太平洋区域最大规模之一。尽管人群沙眼和泌尿生殖道感染高流行，未发现两个解剖部位间交叉感染的证据。随着瑙鲁向消除沙眼公共卫生问题迈进，定期调查衣原体遗传学可能很重要。

ACKNOWLEDGMENTS

我们感谢瑙鲁居民参与这些研究，以及现场工作人员为每项研究收集相关数据的作用。瑙鲁的实验室支持由Shanyko Benjamin提供。对于沙眼调查的贡献，我们感谢国际沙眼倡议的Sarah Boyd；Sightsavers的Cristina Jimenez；所罗门群岛卫生与医疗服务部的Oliver Sokana；以及弗雷德·霍洛斯基金会的Sarity Dodson、Lizzie Jenkins、Richard Le Mesurier、Tessa Hillgrove、Anasaini Cama和Sara Webster。

本研究由弗雷德·霍洛斯基金会使用英国援助资金（主要资助由Sightsavers持有）支持。这包括对S.V.N.的薪资支持。S.-C.A.获得弗雷德·霍洛斯基金会的资金用于实施沙眼调查。核心Tropical Data资金由国际沙眼倡议、Sightsavers和RTI International通过美国国际开发署（USAID）Act to End NTDs East计划提供。A.W.S.是世界卫生组织的工作人员。

K.L.：数据管理，形式分析，调查，方法学，项目管理，初稿撰写，审阅编辑。S.-C.A.：调查，资源，监督，审阅编辑。M.S.：调查，方法学，验证，审阅编辑。S.S.：项目管理，资源，监督。K.D.L.：概念化，审阅编辑。A.W.S.：概念化，方法学，审阅编辑。P.C.：方法学，资源，监督，审阅编辑。S.L.：概念化，监督，审阅编辑。D.W.：项目管理，方法学，监督。J.K.：概念化，方法学，审阅编辑。S.V.N.：概念化，方法学，调查，项目管理，资金获取，监督，审阅编辑。

不存在利益冲突，所有作者已提交ICMJE潜在利益冲突披露表。

作者独自负责本文表达的观点，它们不一定代表其所属机构的观点、决定或政策。