宫颈微生物组在宫颈癌前病变及宫颈癌中的特征解析：基于低深度全基因组测序的创新研究

本研究创新性地采用低深度全基因组测序（LC-WGS）结合超灵敏染色体非整倍体检测技术（UCAD），系统解析了从良性病变、宫颈上皮内瘤变（CIN）到宫颈癌（CC）进程中宫颈微生物组的物种水平动态变化。研究发现随着病变程度加重，乳酸杆菌（如Lactobacillus crispatus）显著减少（≤CIN2组32.9% vs. CC组8.8%），而Gardnerella、Bacteroides等病原体富集。CC组表现出最高的微生物多样性（Shannon指数, P=0.045），且以HPV16（11.8%）、Bacteroides（55.4%）和Porphyromonas（25.2%）为主导。通过LEfSe和随机森林分析鉴定出HPV16、HPV35、Parvimonas micra等CC特异性生物标志物。该研究为微生物-HPV协同致癌机制提供了新见解，对开发微生物组靶向诊断和治疗策略具有重要意义。

　　

引言

宫颈癌（CC）仍是全球重大健康负担，2020年GLOBOCAN数据显示其年新发病例约60.4万、死亡病例34.2万。虽然多数人乳头瘤病毒（HPV）感染可被宿主免疫清除，但持续性高危HPV（hr-HPV）感染被明确认为是宫颈上皮内瘤变（CIN）及后续癌变的主要病因。新兴证据强调，宫颈微生物组（CM）——一个包含细菌、病毒和真菌的复杂微生物群落——在调节HPV致病机制中起关键作用。值得注意的是，CM组成的改变可能影响宿主对HPV获得、持续存在及肿瘤进展的易感性。

在健康的宫颈阴道生态系统中，乳酸杆菌（Lactobacillus）物种通过产生乳酸占主导地位，维持最佳低pH微环境，抑制病原体过度生长并增强黏膜免疫。病理性的菌群失调以乳酸杆菌耗竭和厌氧菌（如Gardnerella、Prevotella）增殖为特征，启动一系列有害事件：上调细胞外基质金属蛋白酶诱导剂增强MMP-8活性，损害上皮屏障完整性。这种结构稳态的丧失有利于HPV病毒颗粒渗透到基底角质形成细胞，实现病毒附着、复制及后续上皮内扩散，这是CIN发展的关键前兆。这些发现强调了阐明跨宫颈病变阶段的CM组成变化的必要性，这可能揭示用于风险分层和治疗干预的新型生物标志物。

方法学创新对解决当前CM表征的局限性至关重要。下一代测序技术及其多样化方法学方法的应用，实现了对复杂样本中广泛微生物的非培养依赖检测。值得注意的是，虽然常规16S rRNA测序仅限于细菌属水平鉴定，但我们的研究开创性地将低深度全基因组测序（LC-WGS）与超灵敏染色体非整倍体检测器（UCAD）整合，用于物种水平的微生物分析。通过策略性调整UCAD原本用于染色体拷贝数变异分析的标准流程，我们重新利用了其百分比归一化和Z-score转换算法，实现了跨域（细菌、真菌、寄生虫和病毒）的微生物表征。据我们所知，这代表了LC-WGS/UCAD作为综合诊断框架的首次实施，这得益于定制的生物信息学创新。

材料与方法

本研究在2021年12月至2023年12月期间于首都医科大学附属北京朝阳医院阴道镜诊所进行了一项横断面临床研究，招募了50名需要临床评估的可疑宫颈病变患者。研究方案经北京朝阳医院机构审查委员会（IRB）批准，并获得所有参与者的书面知情同意。从标准化医疗记录中系统提取了人口统计学和临床数据，包括年龄、癌症家族史和妇科病史。

纳入标准包括：临床怀疑宫颈病变需要阴道镜和组织病理学活检；愿意遵守宫颈标本采集程序。排除标准包括： active menstruation or pregnancy；宫颈病变治疗史（如LEEP、冷刀锥切术）； current genital tract infections (e.g., bacterial vaginosis, candidal vaginitis)；确诊的性传播感染（如淋病、梅毒、滴虫病）；采样前1个月内近期抗生素/抗菌药物使用、3天内性交或阴道灌洗；HPV疫苗接种史；确诊的自身免疫性疾病或恶性肿瘤（宫颈瘤变除外）。

在活检前使用细胞刷收集宫颈脱落细胞标本，用于同时进行HPV基因分型、液基薄层细胞学检测（TCT）和微生物分析。使用Cobas 4800 HPV Test（Roche Diagnostics）进行hr-HPV检测，该检测可识别14种hr-HPV基因型（16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68），其中16/18型被指定为极高风险HPV（vhr-HPV）。细胞学解释依据Bethesda系统指南进行，细胞学结果仅用于初始风险分层。组织病理学诊断，包括正常组织、CIN I-III和浸润性癌，基于阴道镜引导下的活检建立。这些诊断由两位经验丰富的病理学家独立审查，他们对临床数据不知情。基于临床行为，CIN I（与低风险HPV相关，年自然消退率约60%）在后续分析中与正常发现归为一组。

使用Amp Genomic DNA Kit (TIANGEN)从宫颈脱落细胞中提取总基因组DNA。使用Covaris超声破碎仪将DNA片段化，产生平均大小为190 bp的片段，使用100 ng片段化DNA与NEBnext Ultra II kit构建测序文库。将8 bp编码序列接头连接到DNA片段，然后进行PCR扩增。文库经过12个循环的PCR扩增制备，通过Illumina HiSeq X Ten平台进行配对末端测序（读长150 bp），测序深度为1.0×覆盖度。每个样本产生约5 Gb的原始测序数据，经过质量控制并与人类参考基因组（hg19）比对。

实施严格的质量控制流程以生成高置信度的clean reads：使用Trimmomatic默认参数去除包含接头序列的reads；如果任一端read包含超过10%的模糊碱基（N），则丢弃paired-end reads；如果任一端read中超过50%的碱基Phred质量得分<5，则排除read对。仅当两端都满足所有质量阈值时，才保留过滤后的reads用于下游分析，确保后续微生物分析的高质量输入。

过滤后的测序数据使用BWA映射到人类参考基因组。未映射到人类基因组的测序reads随后与人类微生物组参考基因数据库（HMRGD）中的参考序列进行比较，该数据库包含细菌、真菌、病毒、原生动物和其他病原微生物。基于微生物比对结果，对识别出的微生物分类群对应的reads进行量化。

为了平衡微生物（包括病原体和共生菌）丰度，UCAD采用了两步归一化流程：首先，每个微生物分类群的原始reads针对每个样本的总微生物组reads进行归一化，得出百分比丰度。其次，使用Z-score算法对跨样本的相对丰度进行标准化。Z-score ≥3 表示相对于队列范围内平均值，某微生物群显著富集或耗竭，反映了与基线条件的显著偏差。具体的Z-score计算公式、均值计算和标准差计算如原文公式(1)、(2)、(3)所示。

统计分析

分类变量使用Pearson卡方检验或Fisher精确检验进行比较，而非正态分布的连续数据则通过Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（多组比较）进行分析。Pearson相关系数用于评估连续变量之间的两两相关性。所有分析均使用SPSS v26.0 (IBM Corp.) 和 R v4.4.0 进行。

微生物组特异性分析方面，使用Simpson、Shannon和Chao1指数在物种水平评估Alpha多样性。基于Bray-Curtis相异度指标的主坐标分析（PCoA）评估Beta多样性，并辅以非度量多维标度（NMDS）可视化组间组成差异。使用Kruskal-Wallis检验与Dunn事后配对比较（P<0.05）进行多组差异丰度分析。采用线性判别分析效应量（LEfSe）算法识别具有显著差异丰度的分类群（对数LDA得分阈值>2.0）。对同一数据集进行随机森林分析以识别和验证关键微生物生物标志物。使用层次聚类按分类相似性对样本进行分组，并生成堆叠条形图以可视化属水平相对丰度。微生物组分析利用了R中的vegan和phyloseq包。所有统计显著性均定义为双尾P < 0.05。

结果

受试者特征

本研究招募了50名就诊于阴道镜诊所并符合纳入标准的患者。其中，8例诊断为良性宫颈炎，3例诊断为CIN I，15例诊断为CIN II，19例诊断为CIN III，5例诊断为CC。值得注意的是，所有5例CC病例均确认为鳞状细胞癌。根据国际妇产科联盟（FIGO）2018分期系统，5例CC病例分类如下：IB2期（n=1）、IB3期（n=1）、IIB期（n=1）和IIIC1r期（n=2）。不同病理组患者在年龄分布（P=0.31）、TCT结果（P=0.14）和HPV感染状态（P=0.50）方面具有可比性。相反，在家族史和妇科病史方面观察到统计学显著差异（P<0.05）。家族史包括遗传 predisposition、遗传性疾病、家族性慢性病和其他重大健康相关事件。妇科病史包括月经失调、子宫内膜增生和子宫内膜息肉等妇科良性疾病。

样本中微生物的分布

随着宫颈病变进展，乳酸杆菌（Lactobacillus）物种的比例呈下降趋势。在CIN2或更轻病变的病例中，主要微生物是乳酸杆菌（32.9%），其次是链球菌（Streptococcus）（11.0%）和加德纳菌（Gardnerella）（5.8%）。在CIN3病例中，乳酸杆菌仍然是最主要的（22.5%），其次是链球菌（15.5%）和HPV16（5.4%）。相比之下，在CC病例中，HPV16（11.8%）成为最丰富的微生物，乳酸杆菌（8.8%）和厌氧球菌（Anaerococcus）（8.8%）紧随其后。

跨宫颈病变组的宫颈微生物组组成和相对丰度

在界（Kingdom）水平，所有组中宫颈微生物组的主要微生物成分是细菌。在门（Phylum）水平，厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）是四个组（N + CIN1合并组、CIN2组、CIN3组和CC组）中的优势门。随着宫颈病变严重程度增加，厚壁菌门的相对丰度降低，而放线菌门从N + CIN1组到CIN3组呈现显著上升趋势。值得注意的是，与其他组相比，CC组的拟杆菌门（Bacteroidetes）和子囊菌门（Ascomycota）丰度显著更高。

在纲（Class）水平，宫颈微生物组的核心微生物纲是芽孢杆菌纲（Bacilli）、拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）。随着病变进展，芽孢杆菌纲逐渐减少，而拟杆菌纲和 fusobacteriia 纲显著增加，其中拟杆菌纲占CC组微生物组的82%。

在目（Order）水平，乳杆菌目（Lactobacillales）、双歧杆菌目（Bifidobacteriales）和拟杆菌目（Bacteroidales）构成了所有组的核心微生物目。乳杆菌目的相对丰度随着病变严重程度逐渐降低，在CC组达到最低水平。同时，拟杆菌目在CC组中丰度最高（79.7%）。

在科（Family）水平，乳杆菌科（Lactobacillaceae）和双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）是所有组中的优势科。随着宫颈病变的进展，乳杆菌科丰度下降，而双歧杆菌科从N + CIN1组到CIN3组增加。

在属（Genus）水平，乳酸杆菌（Lactobacillus）和加德纳菌（Gardnerella）是最普遍的属，随着病变进展，乳酸杆菌呈下降趋势，而加德纳菌呈上升趋势。在CC组中，拟杆菌属（Bacteroides）（55.44%）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）（25.2%）和梭杆菌属（Fusobacterium）是主要属，这三者在其他三个组（N + CIN1、CIN2和CIN3）中的丰度均较低。

Alpha多样性分析

Simpson指数揭示了跨病变组的微生物多样性分层，CC组表现出最高的平均值，其次是CIN3组。N + CIN1和CIN2组具有统计上相似的多样性得分，尽管所有组间未观察到显著的总体差异（P=0.07, Kruskal-Wallis检验）。

相比之下，Shannon指数显示CC组的微生物多样性显著高于CIN2组（P=0.045, Dunn事后检验），CIN3和CIN2组显示出多样性的顺序性降低。

值得注意的是，Chao1指数表明各组间物种丰富度无统计学显著差异（总体P=0.08）。尽管N + CIN1组显示出最高的数值，但事后检验未揭示显著的两两差异。观察到从正常组到CIN3组丰富度呈下降趋势，而CC组与CIN3组相比显示出略微升高的值，但仍低于N + CIN1组。

Beta多样性分析

Venn图分析显示，N + CIN1、CIN2和CIN3组共享54%的物种水平OTU，而所有四组（N + CIN1、CIN2、CIN3和CC）仅共有42%的OTU。

使用基于加权UniFrac的PCoA和NMDS进行的Beta多样性分析显示，四组之间无统计学显著差异（两项分析均P>0.05），表明尽管病变严重程度增加，但微生物群落组成相似性差异极小。

宫颈微生物群落差异比较

物种水平微生物组成的层次聚类分析显示，N + CIN1和CIN2组之间组成相似性密切。惰性乳酸杆菌（Lactobacillus iners）和卷曲乳酸杆菌（Lactobacillus crispatus）被识别为驱动这种相似性的关键判别性生物标志物。随后的Kruskal-Wallis H检验与Dunn事后比较将L. ultunensis和L. crispatus识别为CIN的潜在生物标志物，它们在CC组中的丰度显著降低（P<0.01）。值得注意的是，HPV16和HPV35与CC强相关，突显了它们与微生物失调在宫颈癌发生中的潜在协同作用。

通过LEfSe分析识别差异微生物生物标志物

采用LEfSe分析来识别四组间具有统计学显著丰度变化的微生物分类群（LDA得分 >2.0, P<0.05）。物种水平分析显示，N + CIN1组有两个关键判别性生物标志物：微小脲原体（Ureaplasma parvum）和人疱疹病毒（Human herpesvirus）。相比之下，CIN2组的特征为肉杆菌科（Carnobacteriaceae）和颗粒链菌属（Granulicatella）的富集。值得注意的是，CC组表现出最具判别性的微生物特征，包括物种水平的小单胞菌（Parvimonas micra）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地芽孢杆菌（Geobacillus sp.）、HPV16、HPV81、HPV35、HPV61、Peptoniphilus durdenii、Anaerococcus lactolyticus和志贺氏菌（Shigella sp.）。

随机森林衍生的宫颈病变阶段前20个微生物生物标志物排名

LEfSe基于其在少数参与者中的丰度将人疱疹病毒识别为N + CIN1组的生物标志物。鉴于样本量的限制，该发现的统计显著性需谨慎解读。为弥补此局限性，我们进行了补充性随机森林分析以验证这些结果。随机森林建模将前20个微生物分类群识别为区分宫颈病变阶段的重要生物标志物。柯蒂斯动弯杆菌（Mobiluncus curtisii）表现出最高的重要性得分（平均减少精度），表明其在区分病变阶段中的突出作用。在排名的分类群中，霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）和地芽孢杆菌（Geobacillus sp.）也显示出相对较高的重要性。值得注意的是，HPV16被纳入列表，突显了病毒-微生物相互作用在宫颈病变进展中的参与。乳酸杆菌物种，如L. crispatus、格氏乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）等，被识别为重要生物标志物，反映了它们在维持微生物平衡或促进宫颈病变发展过程中的菌群失调中的复杂作用。总体而言，这前20个微生物分类群及其不同的重要性得分，为了解与不同宫颈病变阶段相关的微生物群落提供了见解，并为进一步探索宫颈病变发展机制和潜在的微生物基础诊断或治疗靶点奠定了基础。

讨论

我们的研究使用物种水平的LC-WGS和定制开发的名为UCAD的生物信息学流程，全面检查了从良性疾病到浸润性宫颈癌的宫颈疾病谱中的宫颈微生物组。我们的发现证实了乳酸杆菌耗竭、微生物多样性增加与CIN进展为CC之间的既定关联。具体而言，我们观察到在CIN1到CC的转变过程中，乳酸杆菌（如L. crispatus）主导地位逐渐下降，同时加德纳菌（Gardnerella）等病原体富集。值得注意的是，CIN和CC队列之间的微生物差异表明微生物对浸润性进展的潜在贡献，因此值得对微生物驱动的致癌途径进行机制性探索。

不同乳酸杆菌物种在CM中的功能作用仍存在争议，新兴证据强调了其对宫颈健康的物种特异性效应。虽然L. crispatus和L. gasseri通常通过酸化和抗炎机制与保护性阴道环境相关，但L. iners与炎症增加和细菌性阴道病易感性升高有关。值得注意的是，Arokiyaraj等人报告了 contrasting 作用：L. johnsonii与HPV持续存在相关，而L. crispatus主导在实现HPV清除的个体中观察到，这表明物种水平的分类分辨率对于理解微生物-HPV相互作用至关重要。与这些发现一致，我们的数据揭示了CM中乳酸杆菌属的 substantial 相对丰度，进一步强调需要在未来的机制和治疗研究中划定物种特异性贡献，而不是将该属视为一个同质群体。

多项研究表明，HPV感染与特定细菌属（包括双歧杆菌属（Bifidobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、巨球形菌属（Megasphaera）、普雷沃菌属（Prevotella）和加德纳菌属（Gardnerella））的丰度增加有关，这些菌属在HPV阳性人群中的流行率高于健康对照。这种关系表明了一个双向反馈回路：HPV感染加剧宫颈微生物组菌群失调，而改变的微生物环境进一步促进病毒持续存在和进展，最终驱动晚期宫颈病变的发展。然而，存在 conflicting 证据，因为一份报告提出，仅HPV可能不足以诱导宫颈阴道微生物组组成的 substantial 变化。在我们的分析中，HPV16和HPV35成为CC组的显著生物标志物，该组在所有队列中表现出最高的alpha多样性指数（Simpson和Shannon）。值得注意的是，在CC组和CIN2组之间观察到Shannon指数值的统计学显著差异（P=0.045），既突显了hr-HPV感染与宫颈癌发生之间的既定关联，也突显了HPV驱动的微生物群落重组与疾病进展期间宫颈微生物多样性升高之间的潜在联系。

一个关键进展在于通过基于LC-WGS的物种水平分辨率分析克服了16S rRNA测序的分类学局限性，实现了细菌、真菌和病毒的检测。严格排除混杂因素（种族、性活动、卫生习惯）以及使用年龄匹配队列加强了内部有效性。样本量小是一个关键局限性，需要进行多中心验证。虽然Simpson和Chao1指数显示组间微生物丰富度或多样性无显著差异，但Shannon指数揭示了CIN2和CC组之间的显著差异，可能反映了该指数独特捕获的稀有物种，需要通过扩大采样来确认。LEfSe将人疱疹病毒识别为N + CIN1组的生物标志物是由于其在少数参与者中的丰度，但随机森林将其排除在 top 判别性微生物之外，表明其稳健性有限。相比之下，微小脲原体和HPV16在不同方法中仍然显著，支持了其生物学相关性。横断面设计也阻碍了区分持续性HPV感染与 transient 感染，进一步限制了因果推断，并强调了进行纵向研究的必要性。未来的队列追踪和整合方法将解决这些局限性，以验证发现并减少小样本量偏差。