IL-17A缺失下耳念珠菌在阴道微需氧生态位中的持续定植机制及其免疫致病机理研究

本综述深入探讨了新兴病原体耳念珠菌（Candida auris）在阴道微环境中的定植特性及宿主免疫应答机制。研究通过构建IL-17A基因敲除（Il17a?/?）小鼠模型，结合体内外实验证实IL-17A通过调控中性粒细胞浸润及抗菌肽S100A8分泌，在防御耳念珠菌阴道感染中起关键作用。该研究为理解免疫缺陷状态下真菌持续性感染的分子机制提供了重要依据，对临床防治具有指导意义。

　　

ABSTRACT

耳念珠菌（Candida auris）是一种新发真菌病原体，以其高耐药性和在人体及环境表面的持久定植能力著称。然而，其在常见表浅感染——外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis, VVC）中的作用仍知之甚少。本研究利用VVC小鼠模型，探究了耳念珠菌的定植能力及阴道防御机制。通过使用雌激素化VVC小鼠模型，研究人员评估了野生型（WT）和IL-17A基因敲除（Il17a^?/?）C57BL/6J小鼠在接种耳念珠菌后的阴道真菌载量、炎症细胞计数及阴道灌洗液中S100A8的浓度。同时，还进行了阴道组织的病理学检查及阴道免疫细胞的流式细胞术分析。此外，在模拟阴道环境的需氧和微需氧条件下，利用VK2/E6E7阴道上皮细胞进行了体外黏附实验。研究证实，Il17a^?/?小鼠中存在耳念珠菌（特别是I、III和IV分支）的持续性定植，且炎症细胞浸润极少。组织病理学分析也支持了这一发现。S100A8浓度分析显示，WT与Il17a^?/?小鼠间存在显著差异，敲除组中S100A8水平较低。进一步地，S100A8水平与炎症细胞计数呈正相关，而与阴道真菌载量呈负相关。流式细胞术分析表明，Il17a^?/?小鼠阴道中性粒细胞数量减少。体外黏附实验则发现，在微需氧条件下，耳念珠菌对阴道上皮细胞的黏附增强。这表明耳念珠菌对阴道上皮有强亲和力，而IL-17A在耳念珠菌相关的VVC中扮演保护性角色。

IMPORTANCE

耳念珠菌是一种新发真菌物种，近期数篇报告在VVC患者中鉴定出耳念珠菌，但关于耳念珠菌与VVC关系及相关宿主因素的研究甚少。本研究利用VVC小鼠模型，证实了在白细胞介素17A（IL-17A）缺陷条件下，耳念珠菌（特别是I、III和IV分支）可实现阴道持久定植，并伴有中性粒细胞浸润减少和S100A8分泌降低。此外，体外实验表明，耳念珠菌对阴道上皮细胞的黏附增强，尤其是在模拟人体阴道微环境的微需氧条件下。我们的发现提示，耳念珠菌表现出强烈的阴道向性，而IL-17A在控制耳念珠菌相关VVC中起关键作用。

INTRODUCTION

念珠菌属（Candida）是机会性真菌，定植于皮肤和黏膜，偶尔引发表浅感染。VVC是最常见的表浅念珠菌病之一，约75%的女性一生中至少经历一次。白色念珠菌（Candida albicans）是VVC的主要病原，占阴道念珠菌分离株的60%–90%，但所有念珠菌物种均可致病。耳念珠菌最初从慢性中耳炎患者中分离，是一种新发真菌物种，因高抗真菌药性、在人和环境中的长期定植能力及引发院内血流感染暴发的潜力而成为全球健康问题。近期少数病例报告识别耳念珠菌为VVC病因，但其发病率极低，且临床中并不常见。另有报告称耳念珠菌可诱导阴道炎症和上皮损伤。然而，关于新发真菌耳念珠菌与VVC关系及相关宿主因素的研究很少。

IL-17A参与对抗表浅念珠菌病的免疫应答。IL-17通路的缺陷或抑制与口咽、食管和皮肤念珠菌病密切相关。但在VVC中，IL-17A的作用存在争议。有研究认为IL-17A对白色念珠菌阴道感染有保护功能，另一些则报告IL-17信号在VVC中非必需。值得注意的是，多数先前研究仅聚焦白色念珠菌，关于非白色念珠菌物种在表浅感染中的研究有限。对于耳念珠菌，既往研究展示了IL-17信号与耳念珠菌皮肤定植的关联，提示IL-17可能在耳念珠菌VVC中也起作用。

本研究利用小鼠雌激素依赖性假动情VVC模型，探究阴道耳念珠菌感染与IL-17A的关系。具体评估了阴道真菌载量、阴道灌洗液中炎症细胞积聚及抗菌肽S100A8的分泌，比较了WT与IL-17A缺陷（Il17a^?/?）小鼠。此外，进行了阴道组织病理学分析、通过流式细胞术评估阴道免疫细胞，及在微需氧条件下检查耳念珠菌对阴道上皮细胞的体外黏附能力，以进一步阐明耳念珠菌VVC的发病机制。

RESULTS

Vaginal persistent fungal colonization in Il17a^?/? mice

研究人员评估了阴道内接种耳念珠菌后的阴道真菌载量，并比较了WT与Il17a^?/?小鼠在VVC模型中的结果。接种后三天，耳念珠菌AR 0382和AR 0385的阴道真菌载量在Il17a^?/?小鼠中显著高于WT小鼠。此外，在Il17a^?/?小鼠中观察到持续定植直至感染后第14天的终点时间点，而WT小鼠的真菌载量随时间逐渐下降。相反，菌株AR 0381在WT和Il17a^?/?小鼠中均显示真菌载量下降，无显著差异。这些结果表明，耳念珠菌，特别是非II分支的菌株，可在IL-17A缺陷条件下建立持续性阴道定植。

Fewer vaginal inflammatory cell infiltration in Il17a^?/? mice

还通过台盼蓝染色和血细胞计数器计数活细胞，基于细胞形态评估了阴道灌洗液中炎症细胞的浸润。与阴道真菌载量趋势相反，接种AR 0382、AR 0383或AR 0385三天后，WT小鼠的炎症细胞数量显著高于Il17a^?/?小鼠。此外，流式细胞术分析确认阴道灌洗液中大多数炎症细胞为中性粒细胞。WT与Il17a^?/?小鼠间阴道炎症细胞数量的显著差异持续至耳念珠菌接种后14天，尽管两组间绝对差异随时间减小。相反，对于耳念珠菌II分支分离株AR 0381，整个实验期间WT与Il17a^?/?小鼠无显著差异。总体而言，这些数据表明I、III和IV分支耳念珠菌分离株能以IL-17A依赖性方式诱导炎症细胞浸润阴道。

Less secretion of antimicrobial peptide S100A8 in Il17a^?/? mice

除阴道真菌定植和炎症细胞浸润外，还评估了接种各耳念珠菌菌株后3、7和14天阴道灌洗液中抗菌肽S100A8的分泌。接种AR 0382、AR 0383和AR 0385后，WT小鼠阴道S100A8浓度在整个实验期间显著高于Il17a^?/?小鼠。相反，AR 0381接种后两组无显著差异。随后检查了真菌载量或阴道炎症细胞数量与S100A8浓度的相关性。关于真菌载量与S100A8浓度的相关性，在AR 0382、AR 0383和AR 0385感染的小鼠中，这两因素间存在显著负相关。此外，在这些组中，阴道炎症细胞数量与S100A8浓度存在显著正相关。总之，这些结果表明抗菌肽S100A8的阴道分泌伴随炎症细胞浸润发生，并有助于有效清除阴道耳念珠菌。

Less neutrophil infiltration in the vagina after C. auris infection in Il17a^?/? mice

基于上述结果，通过流式细胞术进一步评估了接种耳念珠菌AR 0382后3和7天阴道组织中的免疫细胞群。接种后三天，WT小鼠中性粒细胞数量统计显著增加。相反，在Il17a^?/?小鼠中观察到CD8⁺ T细胞和γδ T细胞显著增加。接种后七天，WT小鼠中性粒细胞数量仍较高。两组间在嗜酸性粒细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、γδ T细胞和B细胞中也发现显著差异，尽管淋巴细胞数量的绝对差异相对较小。在接种AR 0385的小鼠中也观察到中性粒细胞和CD8⁺ T细胞反应的类似趋势。这些结果表明，WT小鼠阴道免疫细胞，特别是中性粒细胞，在耳念珠菌感染后显著诱导，可能有助于宿主防御阴道耳念珠菌定植。

Histopathological analysis showed less neutrophil infiltration and greater C. auris colonization in Il17a^?/? mice

鉴于真菌载量和炎症细胞浸润的结果，进行了接种耳念珠菌AR 0382后3和7天阴道组织的病理学分析。WT小鼠中，在两个时间点均未观察到明显的耳念珠菌定植。相反，感染后3和7天均确认中性粒细胞浸润阴道上皮，与流式细胞术发现一致。然而，Il17a^?/?小鼠接种后无显著中性粒细胞浸润。取而代之的是，观察到明显的阴道上皮过度角化，伴有持续性真菌定植。总之，这些组织病理学结果证实Il17a^?/?小鼠阴道真菌载量更高且中性粒细胞浸润减少，支持了阴道真菌载量和流式细胞术分析的发现。

Greater C. auris adhesion to vaginal cells notably under microaerobic condition

基于体内结果，进一步评估了耳念珠菌对阴道上皮细胞的黏附能力，并与白色念珠菌和热带念珠菌（Candida tropicalis）比较。在需氧条件下，某些耳念珠菌菌株表现出比白色念珠菌显著更高的黏附能力，而白色念珠菌、热带念珠菌和耳念珠菌AR 0381间无显著差异。相反，在模拟阴道环境的微需氧条件下，耳念珠菌I、III和IV分支菌株显示出比白色念珠菌显著更大的黏附。同时，II分支耳念珠菌AR 0381的黏附与白色念珠菌相当。这些结果表明耳念珠菌，特别是I、III和IV分支，对阴道上皮细胞有增强的亲和力——尤其是在阴道样条件下——进一步支持了Il17a^?/?小鼠中定植增加的体内发现。

DISCUSSION

VVC是表浅念珠菌病的主要形式之一，虽然白色念珠菌是最常见病原，但所有念珠菌物种均可能引发人类VVC。耳念珠菌最初从无侵袭性念珠菌病患者的耳分泌物中分离。但现在它被认为是一种新发真菌，能在环境及人皮肤和黏膜上长期定植。假设耳念珠菌可能定植人类阴道，导致 prolonged VVC，尽管耳念珠菌VVC是一种罕见疾病，临床中并不常见。然而，由于其低发病率，迄今无报告描述耳念珠菌与VVC的关系或相关因素。本研究中，耳念珠菌，特别是I、III和IV分支，在IL-17A缺陷条件下诱导了持续性阴道定植，并伴有炎症细胞浸润减少。这种持续性定植与抗菌肽S100A8分泌减少和阴道组织中性粒细胞浸润减少相关。此外，耳念珠菌表现出比白色念珠菌更大的对阴道上皮细胞的黏附，尤其是在模拟阴道环境的微需氧条件下。据我们所知，这是首篇报告证明耳念珠菌与VVC间有强关联，特别是在免疫抑制条件下，如IL-17A缺陷。

阴道真菌载量分析显示，WT小鼠中定植随时间逐渐减少。相反，耳念珠菌，特别是I、III和IV分支，在Il17a^?/?小鼠中持续较长时间。此外，Il17a^?/?小鼠阴道灌洗液中炎症细胞的募集显著较低。先前报告显示耳念珠菌能定植WT小鼠阴道。但定植通常在接种后7天减少或消除，与炎症细胞浸润 coinciding。另一研究也报告，阴道炎症细胞的早期募集与白色念珠菌VVC小鼠模型中定植的清除相关。本研究中流式细胞术分析进一步揭示了耳念珠菌阴道感染后WT与Il17a^?/?小鼠中性粒细胞数量的显著差异。IL-17A先前已被证明与中性粒细胞介导的炎症及宿主防御耳念珠菌皮肤感染密切相关。因此，我们的发现表明IL-17A在宿主防御阴道耳念珠菌中也起关键作用，可能通过中性粒细胞募集促进其清除。

关于参与耳念珠菌定植的免疫细胞群，尽管流式细胞术数据显示WT小鼠中性粒细胞数量显著较高，但CD8⁺ T细胞和γδ T细胞计数在两组间也有差异。这些细胞可能补偿性增加并在IL-17A缺陷条件下对抗耳念珠菌的防御反应中起作用。先前研究显示CD8⁺ T细胞和γδ T细胞参与白色念珠菌VVC及其他念珠菌物种引起的感染。但也有报告称CD8⁺ T细胞和γδ T细胞不贡献小鼠模型中皮肤耳念珠菌定植。因此假设，对抗耳念珠菌的免疫防御机制在阴道和皮肤间可能不同，尽管需进一步研究阐明确切机制。

阴道灌洗液中抗菌肽S100A8的分析显示，感染耳念珠菌I、III和IV分支的Il17a^?/?小鼠其浓度显著低于WT小鼠。先前研究描述了S100A8与中性粒细胞募集的强关联。此外，我们早先关于白色念珠菌外阴阴道念珠菌病的研究证明S100A8浓度与阴道炎症细胞浸润正相关。本研究中，在耳念珠菌接种后三天，确认了S100A8水平与阴道炎症细胞浸润间的显著正相关。此外，S100A8浓度与阴道真菌载量间观察到显著负相关。相反，AR 0381（II分支）的结果显示WT与Il17a^?/?小鼠间S100A8水平无显著差异。相应地，阴道真菌载量和炎症细胞数量的差异也极小。这些发现表明，对抗II分支耳念珠菌菌株的阴道防御机制可能不同于其他分支。这种变异可能由于耳念珠菌的分支特异性特征，因为I、III和IV分支主要与侵袭性念珠菌病相关，而II分支菌株更常从耳分泌物中分离，与非侵袭性感染相关。总之，这些结果表明早期S100A8分泌及阴道炎症细胞浸润可能对有效清除非II分支耳念珠菌菌株至关重要。

利用阴道上皮细胞的体外黏附实验显示，耳念珠菌，特别是I、III和IV分支菌株，在微需氧条件下表现出比白色念珠菌更大的黏附。在需氧或微需氧条件下，耳念珠菌II分支菌株与白色念珠菌间无显著差异。这些结果与我们的体内发现一致。报告称阴道环境是微需氧的，特征为低氧水平（约3%–5%）和 elevated 二氧化碳浓度（约5%–7%）。我们的体外实验在这些生理条件下进行，清楚证明了耳念珠菌在模拟阴道的微需氧环境中黏附增强。这些发现与我们的体内结果相关，并为耳念珠菌的分支特异性表型提供了新见解。

我们的研究有几个局限性。首先，我们仅使用了每个耳念珠菌分支的一个菌株。因此，每个分支内的其他菌株可能产生不同结果。但我们的发现清楚显示了I、III和IV分支菌株的一致趋势，与II分支不同。因此，预期II、III和IV分支的菌株在小鼠VVC模型中可能展示类似表型，尽管需进一步调查确认此假设。其次，我们的组织病理学分析揭示了Il17a^?/?小鼠中的真菌定植，伴有阴道上皮过度角化。但这些上皮变化的意义仍不清楚。WT小鼠在耳念珠菌感染后无此类组织学变化，提示此现象可能特异于IL-17A缺陷。先前研究报告了Il17a^?/?小鼠在白色念珠菌口咽念珠菌病中的胃过度角化。基于此发现，过度角化可能代表对念珠菌感染的反应性变化。然而，潜在机制尚未阐明。第三，尽管我们在微需氧条件下进行了体外黏附实验，但我们仅评估了2小时后的黏附。由于VVC通常是慢性感染，需更长期的黏附实验以充分理解持续性定植的机制。然而，在微需氧条件下进行 prolonged 黏附研究具有挑战性，因为阴道上皮细胞在低氧体外环境中可能无法存活较长时间，这在血液和营养供应方面与人体不同。因此，未来研究需要替代平台——如阴道芯片或类器官系统——以评估长期黏附能力。

总之，我们的结果表明耳念珠菌可在IL-17A缺陷条件下建立持续性阴道定植，伴有中性粒细胞和抗菌肽S100A8的诱导减少。此外，耳念珠菌I、III和IV分支菌株展现出在模拟阴道环境的微需氧条件下对阴道上皮细胞黏附增强的独特表型。我们的调查提示耳念珠菌与免疫受损宿主中的VVC有强关联，提供了具有潜在临床相关性的新见解。

MATERIALS AND METHODS

Mice

动物实验使用年龄匹配的雌性6至8周大IL-17A敲除（Il17a^?/?）小鼠（由东京理科大学Iwakura教授惠赠）在C57BL/6J背景上及相应的野生型（WT）C57BL/6J（非同窝）对照。小鼠在日本国立传染病研究所特定病原体免费条件下繁殖和维持。

Candida auris strains and preparation

对于小鼠外阴阴道念珠菌病模型，耳念珠菌菌株AR 0382（分支I）、AR 0381（分支II）、AR 0383（分支III）和AR 0385（分支IV）从CDC的AR Bank获得。每个菌株在30°C酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂上培养2–3天。然后将单菌落转移至YPD肉汤，30°C孵育18–24小时。孵育后，收集细胞，洗涤，并重悬于无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）用于实验。

Mouse vulvovaginal candidiasis model

使用 established 小鼠外阴阴道念珠菌病模型如前所述。简要地，在耳念珠菌接种前一周，给每只小鼠皮下注射0.2 mg β-雌二醇17-戊酸酯（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）溶解于0.1 mL芝麻油中。为维持假动情状态，随后每周一次给予β-雌二醇17-戊酸酯直至实验结束。然后阴道内接种约1.0 × 10⁷菌落形成单位（CFU）制备的耳念珠菌悬浮液以诱导外阴阴道念珠菌病。

Evaluation of vaginal fungal burden and infiltration of inflammatory cells

为评估真菌载量，在异氟烷麻醉下通过用50 μL无菌PBS每洗轻轻冲洗阴道两次从每只小鼠收集阴道灌洗液。吸取的灌洗液系列稀释并铺于补充青霉素/链霉素的YPD琼脂上。平板30°C孵育48小时后计数真菌菌落。阴道炎症细胞用台盼蓝染色，并使用血细胞计数器在光学显微镜下计数，该方法报告与巴氏染色一致。剩余灌洗液离心并在?30°C储存用于后续细胞因子分析。

Histopathological analysis of vagina from infected mice

为组织病理学分析，在接种后3或7天从每只小鼠收集阴道组织，固定于10%中性缓冲福尔马林，乙醇脱水，并按照标准程序石蜡包埋。4 μm厚切片 mounted 于玻璃载玻片上，并用苏木精和伊红或 periodic acid-Schiff（PAS）染色。然后使用光学显微镜进行组织学检查。

Evaluation of vaginal lavage S100A8 concentration

阴道灌洗液中抗菌肽S100A8的浓度使用商业S100A8酶联免疫吸附测定（ELISA） kit（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）测量，遵循制造商说明。

Vagina immune cells isolation and flow cytometry analysis

耳念珠菌接种后三或七天，每只小鼠安乐死，小心分离阴道，洗涤，并 minced。然后将组织与1.3 units/mL Liberase TL（Roche Applied Science, Penzberg, Germany）和200 μg/mL DNase I（Roche Applied Science, Penzberg, Germany）在37°C孵育60分钟并连续旋转。酶消化后，组织 gently 均质化并通过70 μm尼龙网滤器以获得单细胞悬浮液，然后 resulting 阴道单细胞洗涤两次。阴道灌洗液离心并洗涤两次。阴道组织和灌洗细胞用Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit（Invitrogen, California, USA）在室温染色10分钟。死细胞染色后，细胞与各种荧光染料偶联抗体（列于表中）在4°C孵育45分钟。染色后，细胞洗涤并用4%多聚甲醛在室温固定15分钟。然后使用Aurora-CS流式细胞仪（Cytek Biosciences, Fremont, CA, USA）与CountBright Absolute Counting Beads（Invitrogen, California, USA）量化免疫细胞。流式细胞术数据使用FlowJo软件，版本10.10（Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA）分析。

Candida species adhesion assay to vagina epithelial cell line VK2/E6E7

VK2/E6E7，一种人阴道上皮细胞系（ATCC, CRL-2616），在角质形成细胞无血清培养基（K-SFM; Invitrogen, CA, USA）中于90 mm培养皿37°C 5% CO₂气氛培养直至汇合。然后细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液（Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan） detached，洗涤，并 seeded 入24孔板。接种的VK2/E6E7细胞在K-SFM中孵育7天以允许形成汇合单层。白色念珠菌SC5314、热带念珠菌ATCC 750和耳念珠菌菌株AR 0381、AR 0382、AR 0383和AR 0385在37°C YPD琼脂上在需氧或微需氧条件（5% O₂/5% CO₂）培养2–3天。然后将单菌落接种入酵母氮基（BD Difco, USA）与2%葡萄糖肉汤中，并在37°C shaking under 需氧条件或不 shaking under 微需氧条件孵育18–24小时。孵育后，收集念珠菌细胞，洗涤，并重悬于Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基与3-morpholinopropanesulfonic acid和1%葡萄糖中。约5.0 × 10⁴每个念珠菌菌株细胞接种到含上皮细胞单层的每孔中，并在需氧（5% CO₂）或微需氧（5% O₂/5% CO₂条件）下孵育2小时。孵育后，孔 gently 用无菌PBS洗涤三次，黏附细胞用胰蛋白酶/EDTA detached。初始接种物和从每孔 detached（黏附）细胞均铺于YPD琼脂上，30°C孵育24–48小时用于菌落枚举。黏附比率（%）计算为[剥离细胞CFU]/[接种物CFU] × 100。

Statistical analysis

两组的连续变量使用Student t检验比较，假设方差相等。若组间标准偏差不同，则应用Mann–Whitney U检验。对于体外实验中三组或更多组的比较，进行单因素方差分析（ANOVA），随后使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。相关分析使用Spearman等级相关系数。对于所有检验，双尾检验P值小于0.05视为显著。统计分析使用GraphPad Prism，版本10（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）进行。

ACKNOWLEDGMENTS

图1A在BioRender中创建（M. Abe, 2025, https://BioRender.com/esjn6he）。我们感谢疾病控制与预防中心提供本研究使用的抗生素耐药分离库耳念珠菌分离株。

这项工作部分得到日本医学研究开发机构（AMED）新发和再发传染病研究计划 under Grant Number（JP25fk0108579）、Morinomiyako医学研究基金会和JSPS KAKENHI Grant Number 25K29640的支持。

M.A.和Y.M.构思本研究并设计实验。M.A.、S.S.、A.N.和M.S.进行实验和数据收集。M.A.和S.S.分析数据并生成图表。Y.I.、K.S.和Y.M.提供资源。Y.M.监督本项目。M.A.撰写原稿，所有作者审核结果和手稿并批准提交。