内体转录组学揭示卡哈尔体通过多泡体运输的降解新机制

本研究首次系统解析了多泡体（MVB）的RNA转录组，发现多种核内小RNA（如scaRNA、snoRNA、snRNA）通过内体分选复合物（ESCRT）依赖的机制靶向至MVB，并证实卡哈尔体（Cajal body）成分通过内吞-溶酶体途径降解，为核糖核蛋白（RNP）循环提供了全新机制。

　　

Significance

内体是细胞质中膜包被的亚细胞器，作为细胞外囊泡（如外泌体）的生物发生场所，通过分泌特定蛋白质和小RNA参与细胞间通讯和维持细胞稳态。以往研究主要关注外泌体的转录组，但对内体内RNA的身份及其定位机制知之甚少。本研究首次报道了全面的内体转录组，并证明多种核RNA-蛋白质复合物分选进入内体，这一现象此前未被重视。该过程需要内体分选复合物（ESCRT）和细胞内吞区室特征性磷脂的活性。研究为核糖核蛋白（RNP）通过 cytoplasmic endocytic pathway 的循环提供了机制依据。

Abstract

所有真核细胞都分泌外泌体，这是一种源自内吞区室（即多泡体MVB或晚期内体LEs）的细胞外囊泡。外泌体含有多种 cargo，如核酸、蛋白质、脂质和小分子，但这些内容物是否具有生物学功能仍是研究热点。过去十年中，大量研究描述了外泌体的转录组，但对MVB（外泌体生物发生的源区室）的RNA内容知之甚少。本研究确定了高度纯化的MVB的小RNA转录组，并报告了各类核内小调节RNA（如小卡哈尔体相关RNA、小核仁RNA和小核RNA）运输至MVB。该RNA运输过程需要运输所需内体分选复合物（ESCRT） machinery 的功能，但不依赖于典型的LC3脂化介导的选择性自噬。此外，阻断PI3K Class 3酶VPS34（负责将ESCRT machinery招募至内体）的活性，会阻止这些核RNA在MVB中的周转。我们的结果提供了通过 cytoplasmic endo-lysosomal pathway 靶向降解和周转核核糖核蛋白复合物（如卡哈尔体）的机制。

Results

Purification and sRNA-seq of Multivesicular Bodies.

为快速分离MVB，我们构建了稳定表达N端3xHA标记的CD63（一种常规的MVB和外泌体标记物）的细胞系。使用磁性α-HA beads对来自该细胞系的MVB进行免疫沉淀，并进行免疫印迹分析，类似于先前描述的 lysosome-IP 方案。数据显示MVB膜和腔标记物持续富集，而其他细胞器标记物被耗尽。

为确定分离MVB的sRNA转录组，我们使用 ordered two template relay (OTTR-seq) 进行了sRNA-seq。OTTR-seq数据摘要显示几种核内非编码RNA（如scaRNA、snRNA、snoRNA）富集于MVB。为排除一般核污染，我们测试了MVB-IP样品中的核标记蛋白lamin A/C和Histone H4。结果表明这些标记在MVB-IP中缺失。此外，我们分析了OTTR-seq数据集中核前tRNA的水平，与缺乏一般核污染一致，我们发现MVB中前tRNA水平相对于细胞质较低。

为研究MVB中RNA运输与EVs的RNA含量之间的关系，我们比较了MVB、通过条件培养基（CM）差速离心获得的高速沉淀（HSP）以及使用CD63抗体从CM中免疫沉淀的EVs（CD63⁺EVs）的sRNA含量。我们发现，尽管HSP和CD63⁺EVs中的一部分RNA与一般细胞质内容重叠，但分离的组分含有彼此不同且与MVB不同的各种RNA，这表明MVB RNA运输与EVs的RNA含量之间存在相当复杂的关系。

Several Noncoding RNAs Are Detected in MVBs.

使用整理的和公开可用的转录组，我们比较了从MVB和细胞质获得的OTTR-seq读数，发现多种RNA（包括核体RNA，如scaRNA、snoRNA和snRNA）在MVB中富集。使用两种正交归一化方法（transcripts per million (TPM) 和 differential expression seq2 (DEseq2)）证实了这一点。有趣的是，scaRNA的基因体覆盖图显示在转录本末端附近富集。

我们进一步将MVB和细胞质样品与miRbase数据集进行比较，以评估这些区室中miRNA的差异富集，发现几种miRNA被选择性分选进入MVB。

为验证MVB-IP中scaRNA的存在，我们开发了针对scaRNA 2、4和12的独立RT-PCR assay。结果显示，与细胞质相比，MVB-IP中全长scaRNA 2、4和12有适度富集。RT-PCR assay中这种适度的富集与使用OTTR sRNA测序观察到的高水平scaRNA富集形成对比。由于OTTR-seq在检测sRNA读数方面异常稳健，我们推测MVB-IP中高水平的scaRNA富集可能是溶酶体核糖核酸酶将其加工成sRNA片段的结果，这一特征在细胞质scaRNA池中缺失。为验证这一想法，我们将从MVB-IP和细胞质样品中制备的RNA进行CORALL-seq，这是一种能够检测更长转录本的技术，不像OTTR-seq优先捕获较小的转录本。与这一想法一致，CORALL-seq检测到的MVB-IP中相对于细胞质的全长scaRNA富集水平大大低于OTTR-seq获得的sRNA读数。此外，我们使用scaRNA 4探针对细胞质和MVB RNA样品进行northern blot分析，发现MVB样品中全长RNA富集，与OTTR-seq和RT-PCR分析一致。

Small-Cajal Body RNAs Localize into MVBs.

我们的实验表明scaRNA运输至MVB，但并未排除这些RNA与MVB外表面非特异性结合的可能性。为测试scaRNA在MVB内的定位，我们将MVB-IP样品在存在或不存在 detergent Triton X-100 的情况下进行RNase处理。位于MVB内的scaRNA应不易受RNase处理的影响，除非通过添加Triton X-100破坏膜屏障。本实验中测试的三种RNA（scaRNA 2、4和12）仅在存在 detergent 的情况下对RNase处理敏感，这与它们在MVB内的定位一致。

Bafilomycin A1 and Ionomycin Stimulate the Secretion of scaRNAs in EVs.

我们先前表明，用 calcium ionophore ionomycin 处理细胞会导致PM损伤，从而动员MVB与受损的PM融合并进行修复。该过程导致MVB内包含的ILVs释放到细胞外环境作为外泌体分泌。类似地，据报道用 bafilomycin A1 (BafA1) 处理细胞会导致MVB和溶酶体去酸化，从而导致MVB与PM融合并释放外泌体。我们推断，如果scaRNA包含在MVB内，用ionomycin和BafA1处理细胞应导致这些RNA在外泌体内分泌，并在CM中检测到。确实，用这些药物处理细胞导致scaRNA 2和4在从CM沉淀的HSP fraction中分泌。为确定scaRNA是否包含在EVs内部，我们将HSP在存在或不存在Triton X-100的情况下进行RNase处理。HSP中的一部分scaRNA对RNase处理不敏感，除非HSP用RNase和detergent处理，这与scaRNA在分泌的EVs内部的定位一致。

Coilin, a Cajal Body Marker, Localizes to MVBs.

我们接下来检查了MVB内CB蛋白的定位。使用 immunofluorescence (IF) 可视化coilin（一种关键的CB支架蛋白）相对于CD63⁺ cytoplasmic compartments。Coilin（绿色 puncta）与CD63⁺ compartments（红色圆圈）共定位。此外，coilin与MVBs共IP，与其在MVBs中的定位一致。

scaRNA Localization to MVBs Is Independent of LC3 Lipidation.

自噬介导的多种生物分子 lysosomal degradation 对细胞稳态至关重要。ATG7是自噬的关键介质，是LC3脂化（选择性自噬中的关键步骤）所必需的。为测试自噬介导的scaRNA定位到MVB的可能性，我们在 atg7?/? 背景中创建了稳定表达3xHA-CD63的细胞系，并测定MVB-IP中scaRNA的水平。我们的结果显示，在3xHA-CD63-atg7?/? 中LC3脂化被明显阻断，而MVB IPs中scaRNA水平保持不变。在独立测试中，我们通过用torin 1（一种mTOR kinase抑制剂）处理细胞来诱导自噬。结果显示，mTOR抑制对MVB-IP中scaRNA水平没有影响，无论是在野生型还是 atg7?/? 细胞中。

VPS4 Is Required for scaRNA Sorting into MVBs.

ESCRT complexes 对ILV生物发生的各个步骤至关重要。ESCRT complexes 有助于 cargo 分选并促进向内出芽进入内体，随后由VPS4介导的膜芽 scission 形成ILVs。为测试scaRNA分选进入MVB是否与ILV生物发生同时发生，我们在3xHA-CD63细胞系中瞬时表达 dominant negative allele of VPS4 mCherry (VPS4-DN)，并评估MVB-IP中scaRNA的水平。我们的结果显示，VPS4-DN的表达不干扰MVB的IP，而突变体的表达导致MVB-IP中scaRNA 2和4水平减少>50%。

Activity of PI3K, VPS34, Is Required for scaRNA Turnover via Endo-Lysosomal Pathway.

Phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) 是细胞内吞-溶酶体区室的特征性脂质，对溶酶体功能的各个方面至关重要。为测试PI3P是否 required for endo-lysosomal turnover of scaRNAs，我们用SAR-405（一种PI3-kinase VPS34抑制剂）处理3xHA-CD63细胞。该处理显示经典自噬受体p62水平如预期增加。重要的是，SAR-405处理导致MVB-IP中scaRNA 2、4和12水平增加，与PI3P对于在内吞-溶酶体区室中有效周转scaRNA的需求一致。

Discussion

外泌体内包含的RNA cargo 被提议通过 eliciting gene regulatory responses in the recipient cells 或通过 cell autonomous homeostatic mechanism 来介导细胞间通讯的各个方面，该机制旨在清除可能干扰细胞类型特异性功能的RNA和其他cargo。两种机制都可能有助于细胞的正常生理功能，如生长、分化、粘附、免疫信号传导、营养感知，并调节某些病理状况（包括 neurodegenerative diseases 和各种形式的癌症）的进展。然而，由于制备外泌体所涉及的方法学以及推归属于特定功能的RNA分子的选择，外泌体RNA cargo 与 proposed associated function 之间的直接关系的证据并不令人信服。这种RNA的选择取决于几个因素，例如，某种RNA可能在外泌体中相对于其整体细胞水平富集，这受其选择性分选进入MVB的调控。外泌体RNA含量和富集已通过对来自多种细胞类型和不同纯度的CM的可沉淀 fraction 的转录组学进行了测量。分离的MVB/内体的RNA含量的可比分析尚未报道。

我们解决了选择性RNA分选的问题，并报告了高度纯化的MVB的转录组。值得注意的是，我们的MVB-IP方案快速（约30分钟），并且可能保留敏感的内体内容物（如RNA），相对于传统的多步分离方法。此外，MVB-IP方案是模块化的，允许使用独立标记的内体膜标记物（在我们的案例中是 tetraspanin CD63）从多个样品制备相当同质的MVB池。我们的结果显示CD63⁺ MVB和CD63⁺ EVs的RNA含量有一些相似之处和一些差异。这种差异可能表明MVB池的动态和 active regulation，这些MVB池要么 targeted for endo-lysosomal degradation 并因此保留在细胞中，要么 others that discharge at the PM resulting in exosome secretion。

我们的MVB转录组学数据揭示了多种核内非编码RNA（包括scaRNA、snRNA和snoRNA）分选进入MVB。这些RNA形成 diverse multimolecular RNPs 的一部分，这些RNPs指导其他RNA的加工和修饰：snoRNA已知定位于核仁，是核糖体RNA成熟所必需的；snRNA与RBP结合形成snRNP，对mRNA剪接很重要；scaRNA在结构和功能上类似于snoRNA，并组装成称为CBs的大型多聚体结构，指导snRNA的重要修饰，这些修饰是snRNP和rRNA成熟所必需的。此外，几种miRNA也被发现选择性富集于MVB-IP相对于细胞质。有趣的是，一种MVB富集的RNA，miR1246，已知是核RNU2-1 RNA的降解产物，该RNA形成剪接体U2复合物的一部分。

核RNA在MVB中的存在出乎意料，因此我们试图通过开发基因特异性RT-PCR assays 来验证其中一些靶标。我们表明，几种scaRNA与MVB共IP并定位于MVB内部，基于我们对RNase处理敏感性的测试。值得注意的是，通过RT-PCR assays 和 total-RNA-seq 测量的MVB内部scaRNA富集相对于使用sRNA-seq观察到的富集减少。我们建议，当scaRNA分选进入MVB时，可能经历快速周转，因此sRNA-seq可能富集scaRNA的加工和截短片段。另外或 alternatively，使用OTTR-seq的sRNA seq中增加的scaRNA富集可能源于在制备RNA文库之前对MVB样品而非细胞质RNA样品使用RNase处理。此外，大多数细胞质scaRNA池尚未经过内吞-溶酶体途径的加工，因此，在sRNA-seq中出现的可能性较小。相反，对于常规total-RNA-seq则相反，使得未加工的细胞质scaRNA更有可能被包含在文库中。如RNase处理的MVB中所预期的较小的截短版本的scaRNA，不太适合通过total-RNA-seq进行评估。我们观察结果的另一个潜在解释是OTTR-seq和CORALL-seq在检测 distinct RNAs 方面的差异能力，可能基于大小和其他未知特征。CORALL-seq，一种total RNA-seq方法，在捕获某些往往比mRNA转录本短的scaRNA方面可能效率低下。尽管如此，我们的northern blot分析 combined with tests for RNase sensitivity 以及观察到增强外泌体分泌的细胞处理也增加膜保护囊泡中scaRNA分泌的观察，使我们得出结论：scaRNA被分选进入MVB，并可能通过内吞-溶酶体途径周转。

CBs主要是核内无膜亚细胞器，有助于mRNA剪接所需的snRNP成熟。然而，CB成分，如coilin（CBs的主要结构成分）和辅助蛋白，如 survival motor neuron (SMN 1)，先前已在细胞质中检测到，并可能经历 nucleus-cytoplasm shuttling。此外，已知CBs在 mitosis 期间解体，并且随着细胞分裂期间 nuclear envelope 解体，CB成分可能与周围细胞质混合。因此，这些成分的子集可能 subject to turnover，而MVB分选和内吞-溶酶体周转可能有助于这一过程。与这一想法一致，我们显示coilin定位于并可与其CD63⁺ MVB共分离。有趣的是，几种核仁RNP和RNA已知与 mitotic chromosomes 的 perichromosomal layer (PCL) 相关，这有助于在 nuclear envelope reformation 期间 nuclear compartmentalization of PCL associated RNPs and RNAs。然而，一些核RNP和RNA可能被此过程低效捕获并保留在细胞质中。在这种情况下，MVB分选可能通过内吞-溶酶体途径在降解此类核成分方面发挥作用。

Coilin与其他CB成分一起，也是称为 histone locus body (HLB) 的相关核体的一部分，该核体在所有主要组蛋白基因位点附近形成，在那里它指导组蛋白mRNA的成熟。值得注意的是，组蛋白mRNA是我们MVB total-RNA-seq中一些高度代表的转录本。这些观察结果与我们发现的MVB中的snRNA和snoRNA一起表明，MVB分选和内吞-溶酶体周转可能在维持核体稳态方面发挥广泛作用。

自噬相关途径是回收不需要的细胞成分（包括RNA）的重要机制。自噬涉及响应某些 cues（如营养饥饿）回收 bulk cellular components，但也可能 targeted to selective targets。rRNA的选择性自噬先前已在 Caenorhabditis elegans 和酵母中观察到，并被认为在发育过程中以 lysosomal RNaseT2-dependent manner 维持核苷酸稳态。最近，显示LC3依赖性EV加载和分泌途径（LDELS）是MVB分选和随后几种RBP及其相关小非编码RNA的EV分泌所必需的。相反，我们的数据表明代表性核体成分的MVB分选 largely independent of autophagy。我们显示，尽管独立于自噬，核体成分的MVB分选需要 functioning ESCRT machinery，如表达VPS4-DN（损害其在ESCRT依赖性ILV出芽中的功能）后MVB scaRNA水平减少所证明。自噬和MVB周转途径如何捕获 distinct cargo molecules 仍然是一个悬而未决的问题。

Materials and Methods

（此部分为实验方法细节，已按指令省略详细展开，但保留小节标题以保持结构）

Cell-Lines and Cell-Culture.

Cloning, Transient Expression, Lentivirus Production, and Stable Cell-Line Generation.

Multivesicular Body (MVB) Isolation.

MVB RNA-seq.

RT-PCR Assay.

Test for Sensitivity to RNase.

Bafilomycin A1 and Ionomycin Treatments.

Northern Blot Analysis.

Autophagy Inhibition by Torin.

PI3 Kinase, VPS34, Inhibition by SAR-405.

Immunoblotting.

EV Isolation.

IF.

OTTR-seq Pipeline.

CORALL Sequencing Pipeline.