压力跃变NMR技术解析泛素蛋白折叠中间体的非天然β-折叠结构及其在PINK1线粒体自噬通路中的功能意义

本研究通过压力跃变NMR（PJ-NMR）技术首次解析了泛素蛋白折叠中间体的高分辨率结构，发现其采用非天然β-折叠注册（β-sheet registry），该构象与PINK1介导的线粒体自噬（mitophagy）中磷酸化泛素的关键结构特征高度吻合，为理解蛋白质折叠路径与生物功能耦合机制提供了原子级视角。

　　

蛋白质折叠中间体的结构表征挑战

蛋白质折叠通常被描述为在一个粗糙的高维能量景观中进行探索的过程，最终落入低能量的折叠状态。在这一旅程中，蛋白质可能访问对应于亚稳态结构的浅能盆，这些结构可能具有重要的生物学意义。由于亚稳态结构的低丰度和短寿命（毫秒级别），其结构表征一直面临巨大挑战。低丰度限制了传统核磁共振（NMR）的检测灵敏度，同时也使得在没有稳定突变、共价修饰或添加抗体的情况下难以通过X射线衍射进行结晶。

压力跃变NMR技术的创新应用

本研究采用了一种创新性的方法：结合快速压力跃变与先进的NMR测量技术。压力切换被认为是对能量景观最温和且易于可逆的扰动方式，能够在天然缓冲条件下探测蛋白质结构。为了实现这一目标，研究团队开发了一种压力跃变装置，可在几毫秒内将NMR样品池中的静水压力在1巴和2.8千巴之间反复切换。该技术利用压力敏感型泛素突变体（V17A/V26A，称为VA2-泛素）进行研究，这些突变增加了未折叠状态与折叠状态之间的体积差，从而将压力诱导变性的中点从5.4降低到1.4千巴。

发现瞬态折叠中间体

通过二维¹H-¹⁵N压力跃变异核单量子相干（PJ-HSQC）光谱，研究者在VA2-泛素中观测到，除了天然折叠物种的共振峰外，还存在大量微弱的共振峰。这些弱共振在压力下降500毫秒后消失，对应于一种亚稳态结构，其在298 K下以约15 s^?1的速率转换为天然状态。为了确认该中间体并非突变特异性的，研究还检测了L50A泛素突变体，并发现其具有非常相似的化学位移，表明相同的亚稳态折叠中间体存在于两种突变体中，进而通过推断也存在于天然泛素中。

中间体的化学位移分析

为了确定瞬态中间态（I-state）的三维结构，研究团队在重复的压力跃变循环中测量了其骨架¹H、¹⁵N和¹³C的化学位移。与天然状态相比，最大的化学位移差异出现在β1和β5链以及紧邻β5的“S65环”区域。通过TALOS-N软件分析这些化学位移，发现相对于天然结构，存在数量有限的较大骨架扭转角差异，这些差异主要涉及S65环。

CS-Rosetta结构建模

利用CS-Rosetta程序，研究者开发了与I-state化学shift兼容的三维结构模型。 resulting的10个最低能量模型显示出类似天然的拓扑结构，但值得注意的是，所有模型都表现出β5链相对于天然结构发生了两个残基的注册移位。然而，这些模型的骨架原子坐标与平均结构之间的均方根偏差（RMSD）为1.3 ?，表明仍存在显著的异质性。

通过¹H-¹H NOE进行结构精修

为了验证β5注册的变化并提高其坐标精度，研究进行了压力跃变版本的三维NOE实验。 resulting的三维光谱显示了与折叠状态相关的交叉峰，但也出现了许多与折叠结构完全不一致的交叉峰，这些峰仅与β5链的注册移位兼容。例如，观察到β5与侧翼链β1和β3之间的接触（如L67H^N-I3Hγ^a, V70H^N-I44H^N, 和L71H^N-T7Hγ），以及C末端的接触（如R72H^N-L43Hα和L73H^N-L8Hγ），这些都表明与天然状态相比发生了刚性化，并且全部与β5的注册移位一致。

残存偶极耦合（RDC）验证

弱对齐蛋白质中的残存偶极耦合（RDCs）是键向量方向的精确报告者，对结构验证非常有效。研究发现，稀释的约10 mg/mL Pf1丝状噬菌体向列悬浮液足够坚固，能够承受2.5千巴的静水压力。通过测量RDCs，研究发现I-state的RDCs在大小上与天然结构相当，但与天然状态的构象拟合较差（RMSD为2.8 Hz）。将RDCs与NOE约束一起纳入CS-Rosetta计算后， resulting的低能量结构保留了仅化学位移结构的一般特征，但表现出更紧密的收敛（骨架RMSD为0.8 ?对1.3 ?）。

与先前“回缩链”结构的比较

对S65磷酸化泛素（pUbq）和L67S泛素突变体的研究均显示，天然折叠泛素与β5回缩的构象体之间存在平衡。本研究确定的I-state结构代表了野生型泛素在β5回缩状态下的原子分辨率模型。I-state的RDCs与各种回缩链结构的吻合度优于与天然泛素结构的吻合度。然而，S65环在这些结构之间存在显著差异。在本研究的I-state结构中，S65环采用了一个朝向P19环的有序构象，该结构得到了来自Q62、K63和E64残基与P19的NOE的支持。

分子动力学轨迹中的中间体

泛素已被广泛用作蛋白质折叠分子动力学（MD）模拟的模型系统。分析发现，在轨迹中存在三个相对较短的时期，其帧显示的氢键更类似于实验确定的I-state而非天然状态。从这些类似I-state的时期提取的帧通过UMAP算法进行降维，然后使用DBSCAN进行聚类，识别出12个簇，每个簇代表与实验确定的I-state相似的构象，其大部分结构变异性位于3₁₀螺旋（L56-Y59）和S65环区域。

讨论与展望

本研究揭示了压力跃变NMR与弛豫分散和化学交换饱和转移（CEST）等方法在研究构象交换过程方面的互补性。CEST实验表明，泛素的回缩链构象能量足够低，可以在天然条件下被访问，从而实现PINK1的磷酸化。其低能量和与天然折叠的结构相似性表明它很可能作为折叠中间体被访问。事实上，约一半的分子在折叠过程中遵循此路径。

研究在非常长的全原子分子动力学轨迹中观察到，四分之一的折叠/去折叠转变涉及回缩的β5中间体，这与实验研究中的大约一半相比是合理的。此外，该中间态在平衡折叠/去折叠条件下的低种群与其在生理条件下实验观察到的非常低（约0.7%）的种群一致。

压力跃变NMR研究揭示了一种蛋白质的亚稳态构象结构，其寿命太短，无法通过传统技术进行完整的结构表征。这些结果凸显了压力跃变NMR在增加我们对蛋白质折叠过程的理解和探索此类瞬态种群状态的构象空间方面的潜力。