莱茵衣藻中鸟嘌呤存储液泡（GSV）的发现：一种新型氮储备细胞器的超微结构与代谢调控机制

本研究发现莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中存在一种新型细胞器——鸟嘌呤存储液泡（GSV），通过快速冷冻深度蚀刻电镜（QFDEEM）技术揭示了其膜超微结构、鸟嘌呤晶体沉积及其在氮饥饿/补充过程中的动态变化。研究同时鉴定了19个鸟嘌呤代谢相关酶家族和10个转运蛋白基因，并发现多数基因在氮饥饿条件下显著上调。该研究提出了可验证的鸟嘌呤循环模型，为真核微藻氮代谢调控机制提供了重要见解。

　　

Significance

本研究通过快速冷冻深度蚀刻电子显微镜（QFDEEM）技术首次描述了莱茵衣藻中一种新型细胞器——鸟嘌呤存储液泡（GSV），该技术完整保留了其膜超微结构、鸟嘌呤晶体 endowment 以及在外源氮饥饿与补充过程中的形态变化。同时报道了莱茵衣藻基因组中预测参与鸟嘌呤代谢、分解代谢和转运的基因深度清单，其中多数基因在氮饥饿条件下表达增强。我们提出了一个可经基因敲降和标签蛋白验证的鸟嘌呤循环模型，这些发现为真核微藻代谢生理学研究提供了新范式。

Abstract

莱茵衣藻的氮循环研究历来聚焦于外源铵/硝酸盐的可用性与摄取。近期通过拉曼显微镜技术，在多种微藻（包括莱茵衣藻）的细胞质中鉴定出晶体状鸟嘌呤，其信号水平受外源氮可用性影响，表明这些沉积物可能作为氮储备。本研究利用QFDEEM技术实现了这些鸟嘌呤晶体在莱茵衣藻及其他微藻中的可视化，证实它们存在于细胞质液泡内：一种富含高密度膜内颗粒（IMPs）的膜结构包裹着均质的粗颗粒基质，其中堆叠的扁平晶体大量组装。我们将其命名为鸟嘌呤存储液泡（GSV）。在莱茵衣藻及其他衣藻目物种中，每个GSV中心存在一个离散的盘状颗粒区域（disc），晶体在该区域边缘或内部形成，提示其代表鸟嘌呤的无定形态。在莱茵衣藻中，GSV在对数期细胞中大量存在，在无氮培养基中消失，并在氮补充后8小时内重新出现。本研究还比较了GSV循环与酸钙体（acidocalcisome）中多磷酸颗粒的动态变化，并预测了19个酶家族和10个转运蛋白参与莱茵衣藻的鸟嘌呤相关通路，其中多数在氮饥饿条件下显著上调。

Results

Ultrastructure of the GSV in Chlamydomonas reinhardtii

QFDEEM图像证实拉曼显微镜检测到的晶体位于膜包被的GSV内，直径范围250 nm至1.5 μm。对数期细胞中GSV出现频率约50%，拉曼成像提示每个细胞含约15个GSV。晶体呈现多种堆叠模式，其精确结构需通过电子衍射技术解析。每个GSV由一层膜包围，内部充满称为基质（matrix）的未鉴定悬浮物质，其中包含一个精细颗粒状的盘状结构（disc）。晶体从disc边缘或内部形成，表明disc可能代表鸟嘌呤的无定形态，可能通过与其它组分结合影响结晶过程。部分disc存在内部孔洞结构。

GSV Membrane Ultrastructure in Chlamydomonas reinhardtii

GSV膜的P面呈现高密度膜内颗粒（IMPs），与离子转运活性膜特征一致，表明其具备离子传输能力。其E面在蚀刻过程中保持稳定，与酸钙体膜的E面不稳定性形成对比。

GSV Distribution in Microalgae

除莱茵衣藻外，在衣藻目其他成员（如Chlamydomonas monoica、Haematococcus sp.、Dunaliella salina）中也观察到类似GSV结构。在复杂微藻如 Eustigmatophyte（Nannochloropsis oceanica）、Cryptophyte（Chroomonas mesostigmata）和 Dinophyte（Symbiodinium sp.）中虽存在晶体液泡，但未发现disc结构，表明不同谱系演化出不同的晶体形成机制。

GSV Loss with Nitrogen (N)-Starvation in Chlamydomonas reinhardtii

氮饥饿导致GSV逐渐消失：对数期细胞GSV出现率为53%，饥饿2小时后维持不变，4-8小时降至32-31%，15小时后仅剩2%。早期饥饿样本中可见膜破裂的GSV，晶体与disc直接接触细胞质，提示通过膜破裂途径释放氮。4-8小时样本中出现含膜堆叠和 whorls 的小型GSV，但15小时后完全消失。

GSV Biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii

GSV生成可能通过两种途径：现有GSV的二分裂或出芽；氮补充诱导下，饥饿细胞在8小时内GSV出现率达36%，12小时达85%，24小时达100%。新生成的GSV内部特征性包含扁平膜堆叠或whorls，该结构随时间减少，最小GSV（250 nm）已含晶体，表明结晶过程不依赖大小/时间。

Guanine-Crystal Persistence in Stationary Phase

静止期细胞在不同pH条件下保留晶体：pH7条件下GSV出现率35%，晶体存在于GSV内；pH>9条件下晶体存在于大型细胞质液泡中，可持续至少2周。表明急性氮饥饿与静止期程序的氮管理策略存在差异。

The GSV Cycle Is the Reciprocal of the Acidocalcisome Cycle in Chlamydomonas reinhardtii

GSV循环与酸钙体循环呈互补关系：酸钙体在多磷酸盐在应激条件下固化为颗粒，而GSV在生长阶段将鸟嘌呤固化为晶体，在氮胁迫时溶解释放。酸钙体在log期内容物呈糖浆状（syrupy），与GSV的颗粒状disc形成对比。

Guanine Crystals and Polyphosphate Granules in Thin-Sectioned Preparations

传统薄切片技术中鸟嘌呤晶体与多磷酸盐颗粒因无法被环氧树脂充分渗透，在切片过程中脱落形成孔洞，这解释了为何GSV在历史研究中未被识别。

Enzymes and Transporters Mediating Guanine Accumulation and Catabolism in Chlamydomonas reinhardtii

基因组分析鉴定出19个鸟嘌呤相关酶家族（E1-E19）和10个转运蛋白基因。转录组数据显示，氮饥饿2小时后多个基因表达上调超4倍，最高达数千倍（如AZG2/XUV2上调775倍）。关键发现包括：缺乏鸟苷脱氨酶（GSDA）偏向鸟嘌呤积累；鸟嘌呤脱氨酶（GDA1）在饥饿条件下上调40倍；黄嘌呤脱氢酶（XDH1）上调100倍；推测NCS1/ENT1负责鸟苷导入GSV，AZG/UAPA家族基因在饥饿时显著上调，可能负责鸟嘌呤/黄嘌呤导出及腔内pH调控。

Discussion

本研究将莱茵衣藻胞内鸟嘌呤晶体定位为膜包被的GSV，证实其作为动态氮储备的功能。其独特disc结构可能代表鸟嘌呤存储的无定形前体。GSV膜的高IMPs密度提示活跃的转运活动，可能涉及嘌呤底物运输和pH调控。氮饥饿诱导的基因表达变化（尤其是转运蛋白基因爆发式上调）揭示了GSV溶解和氮释放的分子机制。GSV循环与酸钙体循环在氮磷代谢中可能存在协同作用。不同微藻谱系中GSV结构的差异反映了演化适应多样性。本研究为理解真核微藻营养储备策略提供了全新视角，鸟嘌呤晶体作为"自然的多功能工具"可能在水生生态系统氮平衡中发挥关键作用。

Materials and Methods

菌株sta-6（CC-4348）在含9.3 mM NH₄Cl的HSM培养基中培养，氮饥饿时换用无氮培养基。静止期实验采用野生型21gr（pH7条件）和sta6（pH9条件）。QFDEEM样品经液氦冷冻、-80°C蚀刻后铂/碳旋转投影。冷冻替代样品按标准方法制备。数字化皂苷/甘露醇缓冲液处理用于分离GSV结构。