盐度胁迫下香港牡蛎细胞周期蛋白D2（Ch-CCND2）的转录-翻译解耦现象及其在渗透适应中的新机制

本研究针对香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）在离岸养殖中面临的盐度适应难题，首次克隆并解析了其细胞周期蛋白D2（Ch-CCND2）的全长cDNA序列，通过多组织表达谱分析、免疫组化定位及10天盐度暴露实验，发现低盐（5 ppt）和高盐（25/35 ppt）胁迫均显著抑制Ch-CCND2的mRNA转录，但低盐条件下其蛋白表达却显著上调，揭示了海洋无脊椎动物中首例cyclin D2的转录-翻译解耦现象，为贝类盐度适应性育种提供了关键理论依据。

　　

在广西北部湾的钦州茅尾海，一种名为香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）的经济贝类正悄然支撑着中国牡蛎养殖业的半壁江山。这些牡蛎最适宜在15–20‰的咸淡水交汇处生活，温度保持在15–25℃之间时生长最佳。然而，随着离岸养殖模式的推广，它们被迫暴露于开放海域，直面盐度剧烈波动的严峻挑战。历史监测数据显示，当环境盐度持续超过25‰时，牡蛎在12天后开始零星死亡，16天后便可能出现大规模死亡事件。更令人担忧的是，死亡率与盐度梯度呈显著正相关。作为渗透顺应者，牡蛎无法主动调节体内渗透压，盐度波动会迫使它们将大量能量重新分配给渗透调节，进而影响免疫能力、分布格局乃至生存本身。

以往的研究多聚焦于动物通过转录重编程来应对环境胁迫的传统观点，但近年的一些发现表明，某些基因在转录和翻译水平可能表现出不同步的调控现象，即“转录-翻译解耦”。这种非常规的调控机制在双壳贝类应对盐度胁迫过程中是否存在及其生理意义，成为了一个极具探索价值的科学问题。

细胞周期进程是生命活动的基础，而细胞周期蛋白（Cyclins）则是其中的关键调控因子。其中，D型细胞周期蛋白（D-type cyclins）作为G₁/S期检查点的关键分子，广泛被认为是细胞是否进入增殖状态的“决策者”。在哺乳动物中，D型细胞周期蛋白由三个不同的基因（cyclin D1, D2, D3）编码，它们具有高度的序列同源性但表现出不同的组织特异性，并参与调控不同的生理过程。然而，在包括香港牡蛎在内的许多双壳贝类中，基因组中似乎只存在一个D型细胞周期蛋白（通常是cyclin D2）。这种基因拷贝数的差异使得探究其在不同环境胁迫下的功能变得尤为重要。

在此背景下，研究人员将目光投向了香港牡蛎的细胞周期蛋白D2（Ch-CCND2）。为了阐明Ch-CCND2在盐度适应中的具体作用，研究人员开展了一项系统性的研究，其成果发表在《Aquaculture Reports》上。

为开展本研究，作者团队运用了几项关键技术：1) 采用RACE（cDNA末端快速扩增）技术从香港牡蛎鳃组织cDNA文库中克隆获得Ch-CCND2的全长cDNA序列，并进行了生物信息学分析；2) 通过RT-qPCR（实时荧光定量PCR）技术检测了Ch-CCND2在牡蛎不同组织（闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化腺）中的基础表达分布；3) 利用合成肽段免疫小鼠制备了Ch-CCND2的特异性多克隆抗体，并运用免疫组织化学和免疫荧光技术对Ch-CCND2蛋白在鳃组织中的特异性分布进行了精确定位；4) 设计并实施了为期10天的盐度暴露控制实验（设置5、15、25、35 ppt四个盐度梯度），分别采集鳃组织样本，综合运用RT-qPCR和Western Blot技术，平行检测了不同盐度胁迫下Ch-CCND2在mRNA和蛋白质水平的动态表达变化。所有实验用牡蛎均来自中国广西钦州市龙门镇的商业养殖场。

3.1. Ch-CCND2 cDNA的基因结构

研究人员成功克隆了Ch-CCND2的全长cDNA序列（GenBank登录号: PQ408619）。该cDNA全长3735 bp，包含一个876 bp的开放阅读框（ORF）、一个229 bp的5‘-非翻译区（5’-UTR）和一个长达2630 bp的3‘-非翻译区（3’-UTR）。基因组结构分析表明，Ch-CCND2基因由5个外显子和4个内含子组成，在基因组上分布长度近8 kbp，其开放阅读框分布于全部5个外显子中。

3.2. 多序列比对

Ch-CCND2 cDNA编码一个由291个氨基酸组成的蛋白质，其预测分子量为33.36 kDa，理论等电点（pI）为5.14。SMART分析显示，该蛋白包含两个几乎跨越整个序列的细胞周期蛋白框（cyclin box）结构域：第一个位于3–145 aa，第二个位于154–280 aa。多重序列比对显示这两个结构域，尤其是第一个，在香港牡蛎和其他软体动物物种中高度保守。三种牡蛎物种间的cyclin D2蛋白序列一致性超过97.2%。预测Ch-CCND2中存在十个保守的α-螺旋，两个cyclin box中各五个。NetPhos 3.1预测显示，Ch-CCND2蛋白中共有27个潜在的磷酸化位点，包括16个丝氨酸（S）磷酸化位点、9个苏氨酸（T）磷酸化位点和2个酪氨酸（Y）磷酸化位点。此外，预测表明Ch-CCND2蛋白不存在跨膜区信号肽。

3.3. 系统发育分析

基于从GenBank检索的22个物种的D型细胞周期蛋白全长氨基酸序列，采用邻接法构建了系统发育树。分析结果显示，香港牡蛎的cyclin D2与软体动物门的其他物种聚为一支，然后与棘皮动物门的海星（Acanthaster planci）聚在一起。脊索动物门的物种则形成另一大支，并进一步分为cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3三个组。节肢动物（斑节对虾、克氏原螯虾、黑腹果蝇）和线形动物（秀丽隐杆线虫）的cyclin D或cyclin D2样蛋白位于侧支。

3.4. mRNA组织分布

RT-qPCR结果表明，Ch-CCND2 mRNA在所检测的所有组织中均有分布。具体而言，其在唇瓣中的表达水平最高（p < 0.05），其次为鳃和性腺。相比之下，其在闭壳肌、外套膜和消化腺中的表达水平较弱。这表明Ch-CCND2可能在这些具有较高细胞增殖潜力的组织中发挥重要作用。

3.5. 抗血清评估与蛋白定位

Western blot结果表明，cyclin D2蛋白在香港牡蛎的鳃组织中含量丰富，大小约为32 kDa，并且主要以两种主要亚型存在。使用抗CCND2肽段抗体检测了CCND2蛋白在香港牡蛎鳃中的免疫定位。强烈的荧光信号发现于普通丝和主丝基部两侧的表面细胞中。此外，在顶部普通丝前纤毛区域附近的柱状细胞中也检测到明显的免疫荧光信号。Ch-CCND2蛋白主要分布于细胞质中。这为了解双壳贝类鳃丝的生长发育机制提供了重要线索。

3.6. mRNA表达水平检测

构建的cyclin D2基因实时定量PCR扩增标准曲线在测试范围内呈高度线性（R²=0.997），扩增效率达到94.7%。根据C_T值，通过标准曲线确定了盐度处理鳃组织cDNA模板的DNA拷贝数。结果显示，在盐度处理第6天，15‰盐度处理组中的Ch-CCND2转录本数量显著高于5‰、25‰和35‰盐度组。这表明低盐和高盐胁迫均不利于香港牡蛎鳃中CCND2的转录。

3.7. 蛋白表达水平检测

Western blot分析显示，在鳃组织中，Ch-CCND2蛋白在盐度处理初始时含量丰富。经过5‰盐度处理后，其表达量在第2天显著增加，并保持相对稳定直至第10天。在15‰组中，Ch-CCND2表达在10天内无显著变化。当暴露于25‰盐度时，Ch-CCND2表达在第2、4、6天略有下降，然后在第8和10天急剧下降。在初始35‰盐度处理下，Ch-CCND2表达显著下调，在第2天达到最低水平并持续保持低位。总之，低盐诱导了Ch-CCND2蛋白的表达，但随着环境盐度的升高，对Ch-CCND2蛋白表达的不利影响也随之增加。这与mRNA水平的变化趋势相反，清晰地揭示了转录与翻译水平的不一致性，即转录-翻译解耦现象。

本研究旨在通过检测CCND2的表达来评估香港牡蛎对不同盐度胁迫的细胞响应。我们成功从鳃组织克隆了CCND2的全长cDNA序列，并检测了其在不同组织中的基因表达。通过用合成肽段与KLH载体蛋白偶联后免疫小鼠，制备了抗Ch-CCND2蛋白的特异性抗体。利用特异性抗体通过免疫荧光染色技术研究了Ch-CCND2蛋白在鳃组织中的定位。我们进一步检测了Ch-CCND2基因和蛋白在四种盐度处理（5‰、15‰、25‰、35‰）下的表达模式。研究发现，低盐和高盐胁迫均抑制Ch-CCND2的转录，而高盐胁迫抑制Ch-CCND2蛋白表达，低盐胁迫则增强其蛋白表达。综上所述，我们推测高盐胁迫可能抑制Ch-CCND2的蛋白表达，导致细胞周期停滞在G₁/S转换期，有丝分裂事件显著减少。

多序列比对和系统发育树分析表明，cyclin D2蛋白在软体动物中具有高度保守性和密切的亲缘关系，提示其在细胞周期调控中扮演关键角色。据报道，敲低淡水珍珠蚌（Hyriopsis cumingii）鳃细胞中的cyclin D2可诱导细胞周期停滞在G₀/G₁期，表明cyclin D2可能在双壳贝类的细胞增殖中起关键作用。与香港牡蛎cyclin E的结构类似，Ch-CCND2也包含两个密集分布α-螺旋的细胞周期蛋白框。CCND2细胞周期蛋白框的复杂结构有助于与其伙伴CDK4/6结合，从而在细胞增殖信号转导中发挥关键作用。基于系统发育树分析，观察到脊索动物物种通常在其基因组中编码三种不同类型的cyclin D（cyclin D1, D2, D3）。相比之下，迄今为止在香港牡蛎、太平洋牡蛎和淡水珍珠蚌中仅鉴定出单个D型细胞周期蛋白（即cyclin D2）。推测在人类中，扩张的cyclin D基因家族内部发生了精确的功能分化。鉴于cyclin D在不同门类动物间的显著变异，探究香港牡蛎和其他双壳贝类中单个D型细胞周期蛋白如何促进细胞周期进程将是一个有趣的问题。

环境盐度显著影响双壳贝类的生长发育，因为它们无法主动调节其内环境的渗透压。鉴于这种无能为力，D型细胞周期蛋白作为决定细胞是否进行增殖的关键复制检查点，受到各种正性或负性转录调节因子在启动子水平的严格调控，并被广泛认为是水生动物细胞周期从G₁期过渡到S期的关键生物标志物。有观点认为，几种离子转运蛋白，如Na⁺/K⁺-ATPase和Na⁺/Cl^?-协同转运蛋白，参与了水生动物的离子调节和渗透压调节生理，而有丝分裂细胞的减少是为了节约能量用于离子渗透调节。在应激条件下，p53蛋白被激活，随后下调Bcl-3表达，从而限制p52/Bcl-3复合物的形成，并促进近端NFκB结合位点处p52/HDAC1复合物的形成，该复合物主动抑制cyclin D的转录。此外，miR-16和miR-373作为p53通路响应基因毒应激的关键介质，已被证明可靶向cyclin D mRNA进行降解。Ch-CCND2及其相应蛋白在鳃组织中的高表达水平，表明鳃组织具有显著的细胞增殖能力。Cyclin D2也被认为是牡蛎选择性育种的候选基因，并且它与cyclin A、cyclin E和CDK2一样，在空气暴露和冷胁迫下表达下调。本研究发现，低盐和高盐胁迫均显著抑制香港牡蛎鳃中CCND2的基因表达。综上所述，盐度胁迫可能通过激活p53/p21通路对海洋双壳贝类的cyclin D2转录产生负面影响，可能将能量重新分配给渗透调节。

与我们对香港牡蛎cyclin E的研究不同，本研究的结果显示，鳃中CCND2的蛋白表达水平随着盐度的降低而增强。香港牡蛎中的Cyclin D2蛋白以两种主要亚型表达，这可能源于磷酸化等翻译后修饰，并预测存在大量潜在的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化位点。在哺乳动物中，渗透胁迫诱导p38^SAPK2磷酸化cyclin D1的Thr²⁸⁶，导致其蛋白酶体降解，而AMBRA1作为cullin 4 E3连接酶复合物受体介导cyclin D的泛素化和降解。有研究表明，高盐条件导致PI3K-Akt信号通路抑制和p38 MAPK激活，而低盐主要上调参与FoxO和催产素信号通路的基因。FoxO和催产素信号通路都是胰岛素信号和葡萄糖代谢的保守调节器，这与低盐促进牡蛎壳重和尺寸生长的观察一致。并且据报道，FoxO信号通路控制如4E-BP等的调节因子，它抑制eIF-4E的激活，从而通过影响cyclin D2 mRNA从细胞核到细胞质多核糖体的运输来影响蛋白质合成和翻译。在香港牡蛎中，CCND2蛋白主要分布于鳃的细胞质中，并且在普通丝和主丝基部两侧的表面细胞中发现了强烈的Ch-CCND2蛋白荧光信号，这可能为研究双壳贝类鳃丝的生长发育机制提供重要线索。升高的CCND2蛋白表达可能促进香港牡蛎鳃丝基部的细胞增殖以响应低盐胁迫，这可能是其相对耐低盐的原因。总之，盐度胁迫调节的主要信号通路，包括高盐下p38 MAPK通路的激活和低盐下FoxO通路的激活，可能主导了cyclin D2的蛋白稳定性和mRNA细胞定位，导致香港牡蛎中出现转录-翻译解耦。

先前的研究表明，大多数基因在胁迫下表现出mRNA和蛋白质表达的协同变化，但由于翻译前、翻译中和翻译后修饰，并非所有基因的mRNA丰度都与蛋白质表达水平相对应。iTRAQ分析也揭示，牡蛎鳃通过上调转录组研究中先前未发现的特定蛋白的表达，采用多种防御机制来应对各种胁迫源。本研究中，在10天的盐度暴露期间，香港牡蛎的低盐处理导致鳃中cyclin D2 mRNA显著减少，而蛋白质表达却显著上调。cyclin D2蛋白水平的升高可能标志着适应低盐环境的关键分子策略，尽管其抵抗盐度胁迫的具体作用值得进一步研究。

该研究首次从香港牡蛎鳃中分离出CCND2的全长cDNA序列。CCND2 cDNA编码一个291个氨基酸的蛋白质，与其他双壳贝类的CCND2具有高度同源性。CCND2 mRNA在所有检测的组织中均有发现，并呈现出独特的分布模式。通过用合成肽段免疫小鼠，成功制备了抗CCND2蛋白的抗血清，免疫定位表明Ch-CCND2蛋白主要分布于鳃普通丝和主丝基部两侧的表面细胞中。研究还发现，低盐和高盐均不利于Ch-CCND2的基因转录，而在10天的暴露过程中，高盐胁迫减弱了Ch-CCND2蛋白表达，低盐胁迫则增强了其表达。这项研究增进了对牡蛎响应盐度胁迫的细胞分子机制的理解。