细胞色素c氧化酶Ferryl态至氧化态转变的热力学研究及其质子泵送机制解析

本综述聚焦于膜结合呼吸血红素铜氧还原酶（HCOs）中两种ferryl中间体在O2还原过程中的热力学特性，通过等温滴定量热法（ITC）和密度泛函理论揭示了牛细胞色素c氧化酶（CcO）的F→O转化过程（ΔG0 = -24 kcal/mol, E = +1.3 V）。研究首次证明细胞色素a的氧化还原依赖性构象变化是质子泵送（proton pumping）的主要能量来源，为破解分子生物能量学中的关键难题提供了直接热力学证据。

　　

Highlight

生物系统中的氧活化通过金属中心（主要是铁和铜）实现，这些中心存在于金属酶中。这种活化发生在含血红素和非血红素铁的酶中，通过瞬时形成高价铁(IV)-氧中间体（ferryl物种）完成。这些高价系统在多种血红素酶的催化中观察到，如过氧化物酶、血红素过氧化氢酶、加氧酶、卤化酶和呼吸氧还原酶[1][2][3][4][5]。

INTRODUCTION

呼吸血红素铜氧还原酶（HCOs）在能量转换中催化分子氧还原为水，同时将释放的化学能转化为跨膜电化学质子梯度。该梯度由两种机制建立：1）在活性中心消耗的“底物质子”的矢量转移，用于形成水；2）将额外的“泵送质子”从负侧（N-side）易位至正侧（P-side）。第二种机制，即质子泵送，是当代分子生物能量学中未解决的核心问题。尽管这些ferryl形式在能量转换中的地位至关重要，但它们直接且完整的热力学表征仍然缺乏。

MATERIALS AND METHODS

材料。洗涤剂Triton X-100（TX）购自Across，过氧化氢溶液（~30%）购自Fluka。其他化学品均来自Merck。牛心细胞色素c氧化酶（CcO）依照已发表方法[38]在2 mM磷酸钾缓冲液（KPi，pH 8.0）、50 mM K₂SO₄和0.1% TX中分离。纯化后的酶（~200 μM）在液氮中冷冻并保存于-80°C。氧化型CcO的浓度通过其在428 nm处的光学吸收确定（消光系数ε₄₂₈ = 120 mM^-1 cm^-1，氧化还原差谱Δε_{428 red-ox} = 70 mM^-1 cm^-1）。

RESULTS

细胞色素c氧化酶ferryl F中间体的单电子还原如图3所示。将10 μM Fe_m^II（终浓度）（图3，Fe²⁺箭头）注入23 μM F（在KPi缓冲液，pH 8.0，5°C中），触发该状态的消失，通过光谱变化ΔA(580-630 nm)选择性监测。然而，观察到的F消失分两相进行：快速相对应于添加的电子供体对F的还原，以及较慢相，由于铁(IV)-氧物种的自发还原。

DISCUSSION

如先前研究所示，F态的还原与两个元电荷跨膜转移相关[21][46][47][48][49][50][51][52][63][64][65][66]。一个电子从膜一侧转移，与在催化中心用于形成水的一个底物质子从对侧摄取相结合，解释了一个电荷的易位。质子泵送期间，一个质子通过蛋白质从N侧易位至P侧，构成了第二个转移电荷。因此，F→O转换与两个电荷的跨膜转移相关。