环状RNA hsa_circ_0007349通过miR-127-5p/GLUL轴调控牙龈成纤维细胞伤口愈合的作用机制研究

本研究发现环状RNA hsa_circ_0007349在牙周炎中显著上调，通过ceRNA机制竞争性结合miR-127-5p，解除其对靶基因谷氨酰胺合成酶（GLUL）的抑制，进而促进人牙龈成纤维细胞（HGFs）的增殖、迁移、伤口愈合及细胞外基质（ECM）代谢，为牙周软组织修复提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

Highlight

hsa_circ_0007349在牙周炎牙龈组织和LPS处理的HGFs中表达显著升高

为筛选牙周炎患者与健康对照者之间差异表达的环状RNA（circRNAs），我们对四对牙龈组织样本进行了新一代测序。该分析揭示了97个存在差异表达的候选circRNAs（图1A和B）。其中，我们重点关注hsa_circ_0007349以进行进一步验证，因为测序数据显示其显著上调。与此一致的是，通过RT-qPCR验证，hsa_circ_0007349在牙周炎牙龈组织中的表达确实显著高于健康组织（图1C）。此外，在用牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）脂多糖（LPS）刺激的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中，hsa_circ_0007349的表达也以时间依赖性方式增加（图1D）。随后，我们通过Sanger测序证实了hsa_circ_0007349的反向剪接位点（图1E）。RNase R（一种可降解线性RNA但对大多数环状RNA无效的外切核糖核酸酶）处理实验表明，hsa_circ_0007349对RNase R具有抗性，而其线性对应物MAPK1 mRNA则被有效降解（图1F）。此外，用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）处理细胞后，hsa_circ_0007349表现出比其亲本基因MAPK1 mRNA更长的半衰期（图1G）。这些结果共同证实了hsa_circ_0007349在HGFs中的环状结构和高稳定性。

hsa_circ_0007349作为miR-127-5p的海绵并正向调节GLUL表达

越来越多的证据表明，环状RNA可以通过作为竞争性内源性RNA（ceRNA）吸附微RNA（miRNAs）来发挥其生物学功能。为了探索hsa_circ_0007349的潜在功能机制，我们使用CircInteractome和CircBank数据库预测了其可能结合的miRNAs。在候选miRNAs中，miR-127-5p因其在牙周炎中的已知作用及其与hsa_circ_0007349的推定结合位点而被选中进行进一步研究（图2A）。双荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC组相比，共转染hsa_circ_0007349野生型（WT）报告载体和miR-127-5p模拟物（mimic）显著降低了荧光素酶活性，而突变型（MUT）报告载体则消除了这种抑制效应（图2B）。此外，与对照组相比，过表达hsa_circ_0007349显著降低了HGFs中miR-127-5p的表达水平，而敲低hsa_circ_0007349则产生了相反的效果（图2C）。RNA免疫沉淀（RIP）实验进一步表明，与IgG对照组相比，hsa_circ_0007349和miR-127-5p在抗Ago2抗体组中均显著富集（图2D）。这些发现表明hsa_circ_0007349可以直接结合并“海绵吸附”miR-127-5p。

接下来，我们使用TargetScan、miRDB和miRanda数据库预测了miR-127-5p的潜在靶基因。生物信息学分析表明，谷氨酰胺合成酶（Glutamate-ammonia ligase, GLUL）的3'非翻译区（3'UTR）包含一个与miR-127-5p互补的保守结合位点（图2E）。双荧光素酶报告基因实验证实，与miR-NC组相比，共转染GLUL 3'UTR WT报告载体和miR-127-5p mimic显著抑制了荧光素酶活性，而MUT报告载体则阻断了这种抑制（图2F）。此外，在HGFs中过表达miR-127-5p显著降低了GLUL在mRNA和蛋白水平的表达，而抑制miR-127-5p则增加了GLUL的表达（图2G, H）。重要的是，在HGFs中过表达hsa_circ_0007349显著上调了GLUL的mRNA和蛋白表达水平，而敲低hsa_circ_0007349则下调了其表达（图2I, J）。此外，挽救实验表明，同时敲低hsa_circ_0007349和抑制miR-127-5p可以逆转由单独敲低hsa_circ_0007349引起的GLUL下调（图2K, L）。这些结果表明，hsa_circ_0007349通过吸附miR-127-5p来正向调节GLUL的表达。

hsa_circ_0007349/miR-127-5p轴调节HGFs的增殖、迁移和伤口愈合能力

为了研究hsa_circ_0007349/miR-127-5p轴对HGFs功能的影响，我们进行了一系列功能实验。CCK-8实验表明，过表达hsa_circ_0007349显著促进了HGFs的增殖，而敲低hsa_circ_0007349则抑制了增殖（图3A）。细胞划痕实验显示，过表达hsa_circ_0007349增强了HGFs的迁移能力，而敲低hsa_circ_0007349则削弱了迁移（图3B）。Transwell实验进一步证实了这些发现（图3C）。值得注意的是，共转染miR-127-5p mimic可以逆转由过表达hsa_circ_0007349引起的增殖和迁移促进效应（图3A-C）。相反，共转染miR-127-5p抑制剂（inhibitor）则可以挽救由敲低hsa_circ_0007349引起的增殖和迁移抑制（图3A-C）。这些结果表明，hsa_circ_0007349通过抑制miR-127-5p来促进HGFs的增殖和迁移。

hsa_circ_0007349/miR-127-5p/GLUL轴调节ECM代谢

细胞外基质（ECM）代谢的失衡是牙周炎的一个标志。我们接下来研究了hsa_circ_0007349/miR-127-5p/GLUL轴是否参与调节ECM代谢。首先，我们使用针对hsa_circ_0007349的siRNA（si-hsa_circ_0007349）或阴性对照（si-NC）转染HGFs，然后进行了转录组测序（RNA-seq）。基因 ontology（GO）富集分析显示，差异表达基因（DEGs）显著富集在与“细胞外基质组织”、“细胞外结构组织”和“胶原纤维组织”相关的生物学过程中（图4A）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析也表明，DEGs富集在“蛋白质消化吸收”和“ECM-受体相互作用”等通路中（图4B）。我们随后通过RT-qPCR验证了RNA-seq结果中一些关键的ECM相关基因的表达。如图4C所示，敲低hsa_circ_0007349显著降低了COL1A1、COL3A1、FN1（纤维连接蛋白1）和ELN（弹性蛋白）的mRNA表达水平，而增加了MMP1、MMP3和MMP9的表达。Western blotting分析进一步证实，敲低hsa_circ_0007349降低了I型胶原（COL1）和III型胶原（COL3）的蛋白表达，但增加了MMP9的蛋白表达（图4D）。此外，挽救实验表明，同时敲低hsa_circ_0007349和抑制miR-127-5p，或同时敲低hsa_circ_0007349和过表达GLUL，都可以逆转由单独敲低hsa_circ_0007349引起的ECM相关基因（COL1A1, COL3A1, MMP9）的表达变化（图4E, F）。这些数据表明，hsa_circ_0007349/miR-127-5p/GLUL轴在调节HGFs的ECM代谢中起着关键作用。

体内敲低hsa_circ_0007349可减轻小鼠实验性牙周炎的严重程度

为了评估hsa_circ_0007349在体内的病理作用，我们建立了一个小鼠实验性牙周炎模型。将携带靶向小鼠同源物mmu_circ_0007349的shRNA（sh-circ）或乱序对照shRNA（sh-NC）的腺相关病毒（AAV）局部注射到小鼠牙龈沟内，以敲低mmu_circ_0007349的表达（图5A）。首先，我们通过RT-qPCR证实，与sh-NC组相比，sh-circ组牙龈组织中mmu_circ_0007349的表达显著降低（图5B）。Micro-CT分析显示，与未结扎（Sham）组相比，结扎（Ligation）+ sh-NC组小鼠的牙槽骨丧失（ABL）显著增加。然而，与Ligation + sh-NC组相比，Ligation + sh-circ组小鼠的ABL显著减少（图5C, D）。组织学分析（H&E染色）显示，Ligation + sh-NC组小鼠的牙龈组织存在严重的炎症细胞浸润、上皮钉突延长和结缔组织破坏，而这些病理变化在Ligation + sh-circ组中得到明显缓解（图5E）。马森三色（Masson’s trichrome）染色进一步表明，Ligation + sh-NC组小鼠牙龈组织中的胶原纤维含量显著减少，排列紊乱，而在Ligation + sh-circ组中胶原纤维的破坏得到减轻（图5F）。此外，与Ligation + sh-NC组相比，Ligation + sh-circ组牙龈组织中COL1和COL3的蛋白表达水平上调，而MMP9的蛋白表达水平下调（图5G）。这些体内实验结果表明，敲低mmu_circ_0007349可以通过促进胶原沉积和抑制MMP9表达来减轻实验性牙周炎的严重程度。

Discussion

随着高通量测序技术的进步，大量环状RNA（circRNAs）被证实与牙周炎有关。然而，大多数circRNA在人牙龈成纤维细胞（HGFs）中的具体功能仍不清楚。我们的研究首次发现hsa_circ_0007349是一种在牙周炎组织和LPS刺激的HGFs中显著上调的新型circRNA，并通过阐明其通过miR-127-5p/GLUL轴发挥作用，为牙周病理的调控机制提供了新的见解（图6）。

我们首先通过circRNA测序结合体外验证，证实了hsa_circ_0007349在牙周炎中的上调及其环状特性。随后，我们揭示了一个新的ceRNA机制：hsa_circ_0007349通过直接结合miR-127-5p作为分子海绵，解除miR-127-5p对其靶基因GLUL的抑制，从而上调GLUL表达。功能实验表明，这一轴在调节HGFs的增殖、迁移和伤口愈合能力中至关重要。此外，通过转录组测序和分子生物学实验，我们将这一轴与ECM代谢联系起来，证明其调控关键ECM成分（如胶原）和降解酶（如MMPs）的表达。最后，我们在小鼠牙周炎模型中证实，体内敲低hsa_circ_0007349的同源物可以减轻牙槽骨丧失和组织破坏，突出了其病理意义。

我们的研究结果与越来越多的证据相一致，这些证据表明circRNA-miRNA-mRNA网络在牙周炎中扮演着重要角色。例如，Du等人报道circ_0085289通过吸附let-7f-5p来缓解LPS诱导的牙周膜细胞损伤。本研究的创新之处在于首次将hsa_circ_0007349/miR-127-5p/GLUL轴与HGFs的功能和ECM代谢联系起来，为理解牙周软组织破坏和修复的分子机制提供了新的视角。GLUL（谷氨酰胺合成酶）催化谷氨酰胺的合成，而谷氨酰胺是细胞增殖和基质合成的重要能量来源和前体分子，这可能部分解释了其促进伤口愈合的作用。然而，该轴在牙周炎炎症反应中的具体作用仍需进一步研究。

Conclusion

本研究证明，hsa_circ_0007349在牙周炎中上调，并通过拮抗miR-127-5p来调节细胞增殖和迁移，进而增强GLUL表达。这是首次将circRNAs与牙周软组织修复联系起来的研究，并为探索牙周修复和再生方法提供了新的理论框架。