咖啡因通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路改善二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝细胞癌

本研究聚焦肝细胞癌（HCC）防治难题，针对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的HCC模型，系统探究了咖啡因的干预效果及作用机制。研究发现咖啡因通过抑制cAMP-PKA-CREB信号通路，显著改善肝功能指标、减轻病理损伤并抑制肿瘤细胞增殖，为咖啡因及其衍生物作为HCC辅助治疗策略提供了重要的实验依据和新的研究方向。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，其发生发展与慢性肝炎病毒感染、肝硬化等多种因素密切相关。目前临床治疗手段有限，索拉非尼等靶向药物易产生耐药性和毒副作用，患者预后较差。近年来大量流行病学研究表明，长期咖啡饮用与HCC风险呈显著负相关，但咖啡中的主要活性成分咖啡因具体通过何种分子机制发挥保护作用尚未明确。二乙基亚硝胺（DEN）作为强致癌物，可通过干扰DNA修复机制诱导HCC，是常用的化学诱导动物模型工具。

为深入揭示咖啡因的防癌机制，来自安徽省立医院（安徽医科大学附属合肥医院）药学部的研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》发表了最新研究成果。该研究通过建立DEN诱导的大鼠HCC模型，结合多组细胞实验，首次系统证实咖啡因可通过抑制环磷酸腺苷-蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白（cAMP-PKA-CREB）信号通路，显著改善肝功能指标、减轻肝脏病理损伤并抑制肿瘤细胞增殖。

研究人员主要采用以下关键技术方法：通过DEN诱导建立大鼠HCC模型并进行咖啡因干预；使用自动生化分析仪和化学发光免疫分析系统检测血清肝功能指标及甲胎蛋白（AFP）水平；采用苏木精-伊红（H&E）、Masson三色和天狼星红染色进行肝脏组织病理学分析；运用免疫组化和免疫荧光技术检测A2AR、CD73、HIF-1α等蛋白表达；通过蛋白质印迹法（Western blot）分析关键信号通路蛋白表达；采用实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平；使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖活力；通过siRNA转染和质粒转染技术调控基因表达；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞内cAMP水平及炎症因子含量；运用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构。

3.1. 咖啡因对DEN诱导的大鼠HCC的保护作用

研究显示，使用体重300-350g的大鼠建模可显著提高DEN诱导HCC模型的成功率。咖啡因（20 mg/kg）干预能明显改善大鼠肝脏指数，减轻体重下降和腹部肿胀症状，表明咖啡因对DEN诱导的HCC具有显著保护作用。

3.2. 咖啡因改善糖酵解代谢的血清生物标志物

DEN处理显著升高血清活性氧（ROS）、蛋白质羰基化和乳酸水平，降低谷胱甘肽（GSH）和葡萄糖含量。高剂量咖啡因能有效逆转这些变化，提示DEN诱导HCC可能与氧化应激和糖酵解代谢异常有关。

3.3. 咖啡因改善DEN诱导HCC大鼠的血清学和病理学标志物

咖啡因显著改善DEN引起的血清总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）等肝功能指标异常，同时提高白蛋白（ALB）和总蛋白（TP）水平。组织染色显示咖啡因减轻肝组织慢性损伤和胶原沉积。

3.4. 咖啡因通过抑制cAMP-PKA-CREB信号通路改善DEN诱导的大鼠HCC

免疫组化结果显示，咖啡因显著降低DEN诱导的A2AR、CD73和HIF-1α蛋白表达上调。Western blot分析表明咖啡抑制CREB、PKA、A2AR、CD73和HIF-1α蛋白过度表达，同时降低肝组织cAMP水平。基因检测显示cAMP-PKA-CREB信号通路相关基因表达发生显著变化。

3.5. 咖啡因对DEN诱导的大鼠HCC的保护作用

免疫组化检测发现咖啡因显著抑制PKA、CREB和AMPK蛋白异常表达。ELISA检测显示咖啡因降低血清白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和PKA水平。TEM观察发现咖啡因改善线粒体损伤形态。

3.6. 咖啡因通过抑制cAMP-PKA-CREB信号通路保护DEN诱导的大鼠HCC

免疫荧光检测证实咖啡因显著降低A2AR、CD73和HIF-1α蛋白表达。细胞实验表明咖啡因（10 mM）抑制三种大鼠HCC细胞系（McA-RH7777、CBRH7919和RH-35）的活力，下调PKA和CREB蛋白表达，降低细胞内cAMP水平。

3.7. cAMP-PKA-CREB信号通路的激活增强HCC细胞的活化增殖

使用PKA特异性抑制剂H89（20 μM）可抑制HCC细胞系中PKA蛋白表达，而咖啡因能逆转H89引起的PKA表达降低。咖啡因显著抑制细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达，CCK-8检测显示咖啡因抑制细胞增殖。CREB过表达实验进一步证实咖啡因通过调控cAMP-PKA-CREB信号通路抑制HCC细胞增殖。

3.8. 抑制cAMP-PKA-CREB信号通路降低HCC细胞的活化增殖

siRNA沉默CREB表达增强咖啡因对HCC细胞增殖的抑制作用，降低AFP分泌水平。使用cAMP类似物Bt2-cAMP（0.2 mM）激活cAMP信号通路可促进HCC细胞增殖，而咖啡因能有效抑制这种促进作用，降低细胞内cAMP水平。

研究结论表明，咖啡因通过竞争性抑制腺苷受体A2AR，下调cAMP-PKA-CREB信号通路活性，从而发挥对DEN诱导HCC的保护作用。这一发现不仅为咖啡因的防癌机制提供了新的分子解释，更重要的是为开发咖啡因及其衍生物作为HCC辅助治疗策略提供了重要的实验依据。研究人员在讨论中指出，能量代谢失衡正逐渐成为HCC的重要风险因素，恶性转化的肝细胞通常伴随着整体代谢网络的重排。cAMP/PKA/CREB信号通路在促进肝脏肿瘤生长中起关键作用，而咖啡因通过调控这一通路，显著改善氧化应激和糖酵解代谢异常，保护线粒体功能，抑制炎症反应，最终达到抑制肿瘤发展的效果。

该研究的创新性在于首次通过动物实验和细胞实验证实了咖啡因通过抑制cAMP-PKA-CREB信号通路对DEN诱导的HCC发挥保护作用，为咖啡因及其衍生物作为HCC辅助治疗药物提供了重要的临床前研究基础。未来研究需要进一步关注咖啡因及其衍生物在局部肿瘤组织中的浓度分布，以及其与其他治疗药物的协同效应，推动咖啡因类化合物向临床转化应用。