工程化大肠杆菌实现S-选择性2-羟基异戊酸生物合成：新酶发现与代谢途径优化

本研究针对S-构型2-羟基异戊酸(S-HIV)缺乏高效生物合成路径的问题，通过发掘4-羟基扁桃酸合酶(HmaS)对脂肪族α-酮酸的新催化活性，设计S201F突变体消除副产物生成，结合亮氨酸合成途径系统优化，最终在2-L补料发酵中实现33.9 mM (4.0 g/L)的S-HIV产量，为手性α-羟基酸提供了可持续的生物制造策略。

　　

在生物制造领域，手性α-羟基酸(α-HAs)作为高附加值化学品，在药物合成、化妆品和生物材料制备中具有广泛应用。其中2-羟基异戊酸(2-HIV)因其在制药、化工和聚合物工业中的应用潜力而备受关注，特别是作为生物基聚酯的单体构建单元，能够调控材料的热稳定性、机械强度和降解特性。然而现有生物合成研究主要集中于R-构型2-HIV(R-HIV)的生产，对于S-构型2-HIV(S-HIV)的高效生物合成路径仍属空白，这严重限制了光学纯S-HIV在手性催化、合成生物学和先进材料开发中的应用。

针对这一技术瓶颈，厦门大学研究团队在《BioDesign Research》发表了创新性研究成果。研究人员从天然羟基化和脱羧反应中获得灵感，发现来源于东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的4-羟基扁桃酸合酶(HmaS)对脂肪族α-酮酸2-酮基-4-甲基戊酸(2-KMP)具有非经典催化活性，能够将其转化为S-HIV。通过理性设计获得HmaS S201F突变体，有效消除了对芳香族酮酸底物的活性，显著减少了(S)-扁桃酸(S-MA)和(S)-4-羟基扁桃酸(S-HMA)等副产物的生成。结合大肠杆菌L-亮氨酸生物合成途径的系统优化，最终实现了S-HIV的高效从头生物合成。

研究采用的关键技术包括：酶理性设计与分子对接模拟、全细胞生物催化体系、模块化代谢途径优化（涉及alsS、ilvCD、leuABCD等基因操作）以及2-L规模fed-batch发酵工艺。所有实验均使用大肠杆菌MG1655(DE3)作为宿主菌株。

3.1. Biocatalytic approach reveals a novel activity of HmaS for S-HIV synthesis

研究人员构建了包含奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶(PmLAAD)和HmaS的生物催化级联体系，通过LC-MS/MS分析证实反应产物与标准品S-HIV具有相同的保留时间和特征离子碎片(m/z 117.0538和71.0484)，手性分析进一步确定产物为S-构型，首次揭示了HmaS对2-KMP的新型催化活性。

3.2. Engineering HmaS with minimal byproduct formation

通过结构引导的理性设计，将HmaS第201位丝氨酸突变为苯丙氨酸(S201F)。分子对接表明该突变保持了与2-KMP的结合能力(结合能-4.04 kcal/mol)，同时通过空间位阻效应阻断了芳香族酮酸底物的结合。实验验证显示突变体完全消除了S-MA生成，而保留了对2-KMP的催化活性。

3.3. De novo synthesis of S-HIV in metabolically engineered E. coli

将野生型HmaS和突变体HmaS(S201F)分别导入大肠杆菌，构建工程菌株EcT7-HmaS和EcT7-HmaS*。发酵72小时后，野生型菌株产生1.27 mM S-HIV但伴随大量S-HMA和S-MA副产物，而突变体菌株虽产量略低(1.0 mM)但基本消除了副产物生成，证实了工程化策略的有效性。

3.4. Optimization of the leucine pathway for enhanced production of S-HIV

通过模块化途径优化显著提升产量：引入枯草芽孢杆菌来源的乙酰乳酸合酶(AlsS)使产量提高4.6倍至4.6 mM；过表达ilvCD操纵子进一步将产量提升至6.4 mM；联合过表达leuABCD操纵子最终在摇瓶中获得8.1 mM的S-HIV产量。研究发现反馈抑制 resistant 突变体leuA*(G462D)反而导致产量下降，表明前体2-KMP的过度积累可能抑制HmaS活性。

3.5. Fed-batch fermentation for high-level production of S-HIV

在2-L规模fed-batch发酵中，最佳工程菌株EcT7-sHIV*-IlvCD-LeuABCD在30°C、100 μM IPTG诱导条件下培养159小时，细胞密度(OD₆₀₀)达到16.2，S-HIV产量达到33.9 mM (4.0 g/L)，但后期伴随超过300 mM的乙酸积累，提示需进一步优化代谢网络减少副产物生成。

该研究首次实现了S-构型2-HIV的高效生物合成，通过发现HmaS的非经典催化活性并对其进行理性改造，结合代谢途径的系统优化，建立了从可再生碳源到S-HIV的完整生物合成路线。研究不仅为解决手性α-羟基酸的可持续生产提供了创新策略，还拓展了Fe(II)依赖双加氧酶的催化功能认知，为多样化手性砌块的生物制造奠定了坚实基础。未来通过进一步消除乙酸等副产物积累、优化酶催化效率，有望实现更高产量的S-HIV生产，推动其在生物材料和高值化学品中的应用。