金黄色葡萄球菌人工关节感染生物膜体外模拟模型的优化与表征研究

本研究针对人工关节感染(PJI)中金黄色葡萄球菌生物膜形成机制复杂、缺乏有效体外模拟模型的问题，开发了一种创新的体外生物膜研究模型(InVitrOs)。通过系统优化培养基成分(BLE+)、氧浓度(2.5% O2)、培养时间(72h)和钛钉悬浮培养方式，成功实现了对MSSA(SH1000)和MRSA(USA300)菌株生物膜的差异化表征，为临床诊断工具开发和精准治疗策略制定提供了重要技术平台。

　　

在骨科植入物相关感染领域，人工关节感染(Prosthetic Joint Infection, PJI)始终是困扰临床医生的重大挑战。这种感染往往迁延不愈，最终发展为慢性感染，其核心原因在于细菌在植入物表面形成的生物膜(biofilm)。生物膜是一种由细菌聚集形成的复杂三维结构，外部包裹着细胞外基质(ECM)，能够有效抵御宿主免疫系统和抗生素的攻击。在PJI病例中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检出率超过30%，成为最主要的病原体。然而，当前缺乏能够准确模拟PJI环境的体外模型，严重制约了对生物膜形成机制的深入研究和有效治疗策略的开发。

传统研究方法存在明显局限性：常用的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)检测针对的是浮游细菌(planktonic bacteria)，无法反映生物膜的复杂特性；静态模型使用的富营养培养基与感染部位的生理环境相差甚远；Calgary生物膜装置(CBD)虽然专为生物膜研究设计，但使用的塑料材质与临床使用的钛植入物差异显著，且不利于显微镜观察。这些局限性导致研究结果与实际情况存在较大偏差，迫切需要开发一种更接近生理条件的体外模型。

为了解决这一难题，法国兰斯大学的研究团队开展了一项创新性研究，致力于建立一种能够准确模拟PJI环境的金黄色葡萄球菌生物膜体外模型。他们的研究成果发表在《Biofilm》期刊上，为生物膜研究提供了新的技术平台。

研究人员采用了多学科交叉的研究方法，主要包括：使用经喷砂处理的钛盘和钛钉作为生物膜生长载体以模拟临床植入物；通过晶体紫染色(crystal violet staining)定量生物膜生物量；采用菌落形成单位(CFU)计数法分别检测浮游细菌和粘附细菌数量；应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和扫描电子显微镜(SEM)观察生物膜三维结构和细菌存活状态；在缺氧(2.5% O₂)和厌氧条件下培养以模拟骨组织氧环境。研究选用SH1000(MSSA)和USA300(MRSA)两种代表性菌株进行模型验证。

3.a. 选择金黄色葡萄球菌生物膜研究的环境参数

研究人员首先系统评估了营养可用性(MM和BLE培养基)、氧浓度(厌氧和缺氧)和培养时间(0-144h)三个关键参数对生物膜形成的影响。结果显示，中等营养的MM培养基比营养贫瘠的BLE培养基更有利于细菌增殖和生物量积累，但BLE培养基中粘附细菌的比例显著更高(50.20% vs 5.47%)。缺氧条件(2.5% O₂)下，浮游和粘附种群均比厌氧条件下生长更好，粘附细菌比例达到37.54%。时间动力学分析表明，72小时是生物膜形成的峰值期，之后开始进入分散期。这些发现确立了缺氧条件和72小时培养作为模型的关键参数。

3.b. 培养基优化

基于BLE培养基虽然能促进细菌粘附但信号检测困难的现状，研究团队开发了BLE+培养基，适当提高了葡萄糖(0.8 g/L)和氨基酸(1 mg/mL)浓度，使其更接近生理水平同时保持良好的检测灵敏度。实验证明，BLE+在维持较高比例粘附细菌(31.84%)的同时，显著改善了生物膜生物量的检测效果。

3.c. 实施新的生物膜支持物：钛钉

为了区分活性细菌粘附形成的生物膜与沉降的细菌聚集体，研究人员设计了悬浮钛钉模型。钛钉通过专用支架固定在96孔板盖子上，部分浸没在培养基中。与钛盘模型相比，钛钉上的细菌密度较低(3.5 × 10⁵ vs 9.91 × 10⁵ CFU/mm²)，但成功避免了聚集体沉降的干扰。CLSM和SEM观察显示，钛钉上形成了约25μm厚的生物膜，其中活细菌比例达62%，证明了该模型的有效性。

3.d. 消除静止期浮游细菌和营养补充

为了进一步减少浮游细菌对生物膜发展的影响，研究人员引入了培养基更新策略：在8小时初始粘附后更换新鲜培养基，继续培养至72小时。这种方法显著降低了浮游细菌数量(4.8 × 10⁶ vs 3.5 × 10⁸ CFU/mL)，而不影响粘附细菌数量，更好地模拟了体内条件下生物膜的独立发展。

3.e. 最终模型

最终建立的InVitrOs模型采用72小时缺氧培养、悬浮钛钉支持、BLE+培养基和8小时培养基更新的标准化条件。使用该模型对SH1000和USA300菌株的比较研究成功揭示了它们的不同生物膜特性：SH1000形成密集生物膜，而USA300生物膜更分散，具有更小的聚集体和更高的活细胞比例(70% vs 61.7%)。这种差异化表征能力证明了模型在研究不同菌株生物膜表型方面的应用价值。

研究结论表明，InVitrOs模型成功整合了多个关键参数——2.5%氧浓度、BLE+培养基补充、72小时悬浮钛钉培养和培养基更新策略，建立了一个稳健、可重复且生理相关的体外平台。该模型能够同时实现细菌定量(浮游和粘附)、生物量测定、生物膜结构观察和活死细菌比例分析，为临床菌株的生物膜特性研究提供了全面技术手段。

这项研究的重大意义在于解决了传统生物膜模型的局限性，首次在体外较好地模拟了PJI的复杂环境。模型采用的钛材质与临床植入物一致，缺氧条件符合骨组织生理状态，营养条件更接近感染部位实际情况。特别是能够区分活性粘附与被动沉降的设计，为准确研究生物膜形成机制提供了重要保证。

该模型不仅可用于基础机制研究，更具备临床转化潜力。通过快速鉴定临床菌株的生物膜特性，可为个性化治疗提供指导；作为药物筛选平台，能够更准确地评估抗菌药物的效果；其标准化操作流程有利于不同实验室间的结果比较和数据共享。未来通过扩大临床菌株验证范围，进一步完善检测灵敏度，InVitrOs模型有望成为PJI研究和临床诊断的重要工具，推动生物膜相关感染的精准医疗发展。

研究人员计划下一步利用该模型测试更多临床菌株，包括4株MRSA和4株MSSA，通过微生物学、结构学和表型等多参数进行差异化表征，进一步验证模型的 robustness 和应用价值。这项研究为克服抗生素耐药性挑战、开发新型抗生物膜策略提供了强有力的技术支撑，具有重要的科学意义和临床价值。