内生真菌Alternaria alternata YBG8发酵滤液通过破坏细胞壁与膜系统双重靶向策略抑制枸杞根腐病的生物防治机制研究

本研究针对由Fusarium solani引起的枸杞根腐病，通过探究内生真菌Alternaria alternata YBG8发酵滤液的抗真菌机制，发现其能显著抑制病原菌生长、破坏孢子形态、诱导细胞膜脂过氧化及内容物泄漏。LC-MS分析鉴定出Alternariol methyl ether（130.086 μg/mL）、Altenusin（26.664 μg/mL）和Altenuene（18.291 μg/mL）等关键活性成分，证实其通过细胞壁破坏和膜系统干扰的双靶向机制发挥抑菌作用。该研究为开发环境友好型生物农药提供了理论依据和物质基础。

　　

枸杞（Lycium barbarum）作为我国传统的药食同源植物，富含多糖、甜菜碱和类胡萝卜素等生物活性成分，具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等生理功能。然而，在其生长过程中极易受到根腐病的侵害，其中由Fusarium solani引起的根腐病是一种毁灭性的土传病害，发病率随着栽培年限的延长而逐年升高，严重制约了枸杞产业的可持续发展。目前对该病害的防治主要依赖化学杀菌剂和农业措施，但由于病原菌的土传特性，防治效果并不理想，且长期使用化学药剂还会带来环境污染和病原菌耐药性产生等问题。因此，迫切需要开发以生物防治方法为主的综合治理策略。

在此背景下，研究人员将目光投向了具有生防潜力的内生真菌资源。内生真菌是指那些定殖在健康植物组织内部而不引起病害症状的真菌，它们通过生态位竞争、诱导系统抗性和分泌抗菌代谢物等机制保护宿主植物并促进其生长。前期研究中，团队从健康枸杞植株中分离得到一株具有较强拮抗活性的内生真菌YBG8，经形态学和分子生物学鉴定为Alternaria alternata（链格孢菌）。值得注意的是，链格孢菌通常被视为植物病原菌，但也可作为无症状的内生菌定殖于多种健康植物体内，其具体的生态作用取决于宿主基因型、环境条件和微生物组互作等因素。虽然初步证实了YBG8对F. solani的拮抗活性，但其具体的抗真菌作用机制尚不明确，且枸杞内生真菌资源尚未得到系统开发。

为了阐明YBG8发酵滤液的抗真菌机制及其对枸杞根腐病的生防效果，研究团队开展了一系列实验。该研究发表于《Biological Control》，主要采用了以下关键技术方法：通过牛津杯法和浓度梯度法测定发酵滤液对病原菌的抑制率；利用扫描电子显微镜（SEM）观察孢子形态变化；采用商业试剂盒检测碱性磷酸酶（AKP）活性；通过测定丙二醛（MDA）含量、电导率值以及蛋白质和核酸泄漏情况评估细胞膜损伤程度；借助碘化丙啶（PI）染色验证细胞膜完整性；应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析发酵滤液的代谢物组成；最后通过盆栽试验验证发酵滤液对枸杞根腐病的防治效果。

研究结果首先证实了YBG8发酵滤液对F. solani的抑制效果。牛津杯法显示，添加YBG8发酵滤液显著限制了F. solani菌落的扩展，在PDA平板上观察到明显的抑菌圈。浓度梯度试验表明，所有测试浓度（10-50% v/v）的YBG8滤液均能显著抑制F. solani的菌丝生长，且抑制效果呈浓度依赖性。在20%和50%滤液浓度下，培养5天后的抑制率分别达到38.9%和76.4%。基于抑制效果和成本效益的综合考量，后续实验选择20%浓度进行。

通过扫描电子显微镜观察发现，YBG8滤液处理导致F. solani孢子形态发生显著改变。对照组孢子呈现完整饱满的镰刀形结构，表面光滑，边缘清晰；而处理组孢子出现严重的形态损伤，包括表面皱缩、凹陷、破裂和边缘模糊。这些发现表明YBG8滤液可能破坏了孢子的结构完整性或干扰了细胞壁的生物合成。

碱性磷酸酶活性测定结果显示，YBG8发酵滤液处理在培养早期显著增强了F. solani的AKP活性。在9小时时，处理组的AKP活性比对照组高出56.9%。AKP与细胞壁合成和代谢密切相关，特别是在几丁质的磷酸化过程中发挥作用，这一结果提示YBG8滤液可能干扰了细胞壁的生物合成途径。

对细胞膜损伤指标的测定发现，YBG8滤液处理显著增加了F. solani的MDA含量、电导率值以及蛋白质和核酸的泄漏量。在6小时和48小时，处理组的MDA含量分别是对照组的1.36倍和1.15倍；电导率值分别比对照组高50%和41.9%；蛋白质泄漏量分别是对照组的2.71倍和1.32倍；核酸泄漏量分别是对照组的4.79倍和3.18倍。这些结果表明YBG8滤液诱导了脂质过氧化损伤，破坏了细胞膜的完整性。

PI染色结果进一步证实了细胞膜完整性的破坏。对照组大多数孢子未被染色，仅少数F. solani孢子呈现微弱的红色荧光；而YBG8滤液处理的孢子显示出明显的PI吸收，呈现强烈的红色荧光，荧光强度显著高于对照组。结合SEM观察到的孢子表面损伤，这些结果强烈表明YBG8滤液损害了F. solani的细胞膜完整性。

通过LC-MS技术对YBG8发酵滤液进行代谢物分析，共从总离子流图（TIC）中鉴定出252种化合物。这些化合物属于15个以上的主要代谢物类别，其中10个类别各包含7种以上化合物。羧酸及其衍生物（33种化合物）是最丰富的类别，可能与真菌次级代谢和抗氧化防御机制有关；其次是苯及其取代衍生物（25种化合物）和脂肪酰基化合物（24种化合物），表明存在多种芳香族和脂质相关代谢物。

特别值得注意的是，研究人员筛选出15种相对浓度超过10 μg/mL的物质，其中包括Alternariol methyl ether（AME，130.086 μg/mL）、Altenusin（26.664 μg/mL）和Altenuene（18.291 μg/mL）。这些化合物都具有显著的抗真菌活性和抗氧化特性，被认为是YBG8发挥抗真菌作用的关键功能物质。

盆栽试验结果表明，YBG8发酵滤液预处理显著减轻了F. solani接种对枸杞植株的不利影响，表现出良好的生物防治效果。接种后30天，YBG8 + F. solani处理组的病害发生率分别比对照组和F. solani接种组低50.0%和68.7%。

综合讨论部分，研究人员指出YBG8发酵滤液通过多途径抑制F. solani的生长：一方面通过破坏细胞壁结构和干扰其生物合成途径，导致细胞壁完整性受损和酶泄漏；另一方面通过诱导脂质过氧化破坏细胞膜完整性，触发离子外流和渗透失衡，并引起大分子泄漏导致关键代谢功能崩溃。代谢物分析确定的AME、Altenusin和Altenuene可能是关键的抗真菌成分，它们分别通过破坏微生物膜完整性、抑制DNA拓扑异构酶活性、诱导活性氧积累引起脂质过氧化损伤以及干扰几丁质生物合成等机制发挥协同作用。

该研究的重要意义在于首次系统阐明了内生真菌Alternaria alternata YBG8发酵滤液对枸杞根腐病的生物防治机制，发现了其通过细胞壁破坏和膜系统干扰的双靶向策略发挥抑菌作用，并鉴定出了关键活性成分。这为开发环境友好型生物农药提供了理论框架和物质基础，对减少化学农药使用、保护生态环境、促进枸杞产业可持续发展具有重要价值。