ATF3通过上调CHAC1表达促进脊髓损伤后神经元铁死亡的作用机制研究

本研究针对脊髓损伤(SCI)后神经元死亡的分子机制，发现ATF3(激活转录因子3)通过增强CHAC1(阳离子转运调节因子1)表达，驱动神经元铁死亡(ferroptosis)。研究人员通过体内外实验证实，抑制ATF3可降低Fe2+积累、ROS和MDA水平，提升GSH和GPX4表达，改善神经功能。该研究为SCI治疗提供了新的靶点——ATF3/CHAC1信号通路。

　　

脊髓损伤是一种致残率极高的神经系统疾病，常导致患者运动、感觉和自主神经功能严重障碍，给患者生活质量带来沉重负担。尽管近年来出现了神经保护与再生、干细胞治疗和硬膜外脊髓刺激等多种治疗策略，但由于其理化性质不稳定、成本高昂等问题，临床转化面临巨大挑战。更重要的是，脊髓损伤的病理机制尚未完全阐明，尤其是除传统炎症通路外，是否存在其他细胞死亡途径参与其中，仍需要深入探索。

近年来研究发现，铁死亡——一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，在脊髓损伤进程中扮演关键角色。这种细胞死亡方式在机制和形态上不同于细胞凋亡、坏死和自噬，其特征包括谷胱甘肽(GSH)耗竭、脂质过氧化物积累、Fe²⁺大量聚集、活性氧(ROS)水平升高以及线粒体萎缩和外膜破裂。特别值得注意的是，阳离子转运调节因子1(CHAC1)作为铁死亡相关基因，与GSH表达呈负相关，并参与脊髓损伤中的铁转运过程。

与此同时，激活转录因子3(ATF3)作为应激诱导的转录因子，在急性脊髓损伤小鼠中表达上调，可能成为潜在的分子标志物。先前研究表明，ATF3能够减少GSH合成酶的表达，暗示其可能参与GSH的调控。更有趣的是，现有证据支持ATF3在多种疾病（包括脊髓损伤）中诱导细胞铁死亡，并可能调控CHAC1表达。

基于这些发现，研究人员提出科学假设：在脊髓损伤过程中，ATF3可能通过转录机制上调CHAC1表达，从而促进神经元铁死亡，最终加重病情。为了验证这一假设并探索ATF3/CHAC1通路作为脊髓损伤治疗靶点的潜力，研究团队开展了一系列实验。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用C57BL/6JNifdc小鼠建立脊髓挫伤模型，并通过Basso小鼠运动量表评估运动功能；利用免疫荧光、TUNEL染色和qRT-PCR检测ATF3和CHAC1的表达及意义；使用VSC4.1运动神经元细胞，通过H₂O₂诱导细胞损伤建立体外模型；采用siRNA介导的ATF3沉默和CHAC1过表达处理；通过流式细胞术和集落形成 assay评估细胞凋亡和克隆形成能力；使用特定试剂盒检测铁死亡指标如脂质过氧化、GSH水平和铁积累；通过western blot检测核因子红细胞2相关因子2(NRF2)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。

3.1. 铁死亡在SCI模型小鼠中发生，Fer-1可逆转铁死亡

Basso小鼠量表评分结果显示，SCI小鼠评分降低，而Ferrostatin-1(Fer-1)处理可逆转运动功能评估。TUNEL assay结果显示，在SCI模型中观察到神经元凋亡，Fer-1处理可抑制这种凋亡。与对照组相比，模型组神经元细胞数量减少，但Fer-1干预后数量增加。更重要的是，造模后小鼠脊髓组织中Fe²⁺水平升高，而Fer-1可降低该水平。模型小鼠GSH水平显著低于对照组，Fer-1干预后GSH水平增加。透射电镜结果显示，模型小鼠存在线粒体萎缩和外膜破裂，而Fer-1处理的模型小鼠线粒体形态明显改善。这些结果表明，SCI模型小鼠发生了线粒体形态异常的铁死亡，Fer-1可逆转这一过程。

3.2. Si-ATF3促进细胞集落形成和GSH水平，同时降低细胞凋亡、MDA水平、Fe²⁺水平、ROS水平和CHAC1水平

为探究ATF3对神经元细胞的影响，使用H₂O₂(60 μmol/L)诱导神经元细胞损伤并操纵VSC4.1细胞中ATF3表达。qRT-PCR结果显示，ATF3在VSC4.1细胞中成功沉默。ATF3沉默显著促进细胞集落形成并减少细胞凋亡。此外，ATF3沉默明显增加GSH水平，同时降低MDA水平、Fe²⁺水平、ROS水平和CHAC1水平。

3.3. CHAC1过表达逆转了si-ATF3对VSC4.1细胞集落形成、凋亡、Fe²⁺水平、GSH水平、MDA水平和ROS水平的影响

基于上述研究，为探索ATF3与CHAC1之间的相互作用，使用H₂O₂(60 μmol/L)诱导神经元细胞损伤并操纵VSC4.1细胞中CHAC1表达。qRT-PCR结果显示，通过转染成功在VSC4.1细胞中过表达CHAC1。数据显示，与Si-NC + OE-NC组相比，Si-ATF3处理显著增强集落形成并抑制凋亡。相反，共转染si-NC和OE-CHAC1抑制集落形成并促进凋亡。更重要的是，CHAC1过表达完全抵消了si-ATF3对细胞集落形成和细胞凋亡的影响。另一方面，与Si-NC + OE-NC组相比，Si-ATF3 + OE-NC组Fe²⁺、MDA和ROS水平降低，GSH水平升高。然而，在Si-NC和OE-CHAC1作用下，检测到相反的趋势。最重要的是，OE-CHAC1完全逆转了Si-ATF3对上述铁死亡指标的保护作用，Si-ATF3也抵消了OE-CHAC1的作用。最后，检测各组细胞中NRF2和GPX4的蛋白表达水平，结果显示ATF3敲低促进而CHAC1过表达抑制NRF2和GPX4水平，ATF3敲低和CHAC1过表达在NRF2和GPX4表达上相互逆转其作用。

本研究阐明了ATF3介导脊髓损伤的新机制：ATF3上调CHAC1表达，从而驱动神经元铁死亡，最终加重SCI病理。更重要的是，研究发现ATF3沉默可诱导一系列抗铁死亡变化，即增加GSH水平，降低Fe²⁺、MDA和ROS水平。这一发现不仅证实了ATF3在神经元铁死亡中的促进作用，还为进一步探索其特定下游效应分子奠定了基础。

补救实验数据揭示了一个功能性因果联系：ATF3沉默诱导的细胞保护作用（包括增强克隆形成、减少凋亡和抑制铁死亡）可被CHAC1过表达完全抵消。这一发现强有力地表明，CHAC1是ATF3在调节神经元氧化应激损伤中不可或缺的下游效应器。

尽管这项研究揭示了ATF3通过上调CHAC1促进神经元铁死亡从而加重SCI的机制，但仍存在一些不足。在临床应用方面，虽然ATF3和CHAC1已被提出作为潜在靶点，但缺乏高效的干预方法。小分子抑制剂和基因治疗在安全性和递送效率方面需要优化。关于研究的时间维度，尚未探索ATF3和CHAC1在SCI不同阶段的表达变化。此外，只关注短期效应，缺乏关于ATF3和CHAC1调控后SCI长期功能结局的研究。

总之，该研究不仅拓展了SCI分子靶向干预的理论框架，还为开发针对ATF3/CHAC1通路的抑制剂提供了实验依据，未来需要深入研究其临床转化潜力，验证其作为SCI治疗新策略的有效性。该研究成果发表在《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》上，为脊髓损伤的治疗提供了新的思路和方向。