Abstract两栖动物变态过程是甲状腺激素（TH）依赖性的生物学事件，涉及分化组织中广泛的基因表达变化，最终导致生物体结构重塑。这一过程很可能涉及目前尚不明确的表观基因组变化。本研究采用串联质谱技术（MS/MS）探究自然变态过程中组蛋白丰度与组蛋白翻译后修饰（PTMs）的全局性变化，旨在识别TH介导的胚胎后发育过程中潜在的表观遗传调控介质。研究从五只美洲牛蛙（Rana (Lithobates) catesbeiana）个体的血液、肝脏和尾鳍组织中采集样本，包括功能无甲状腺的变态前蝌蚪和变态高峰期（TH水平最高）蝌蚪。另外从五只幼蛙（TH处于超基础水平）采集血液和肝脏组织（尾鳍在此阶段已被吸收）。通过酸提取细胞核富集碱性蛋白（包括组蛋白和其他染色质相关蛋白），采用开放搜索参数对MS/MS数据与牛蛙蛋白质组进行比对，并对修饰组蛋白肽段进行严格统计学评估。研究发现多种组蛋白变异体和异构体的丰度在变态过程中发生变化：所有三种组织中的组蛋白H1.0随变态进程增加，而血液和肝脏中的H1.3相应减少；血液中H2A变异体H2A.X和macroH2A.1减少，肝脏中H2A type 2-C、H2A.Z-2和macroH2A.2增加。通过分析携带甲基化、乙酰化和磷酸化质量偏移的肽段丰度，研究还发现血液和肝脏中H1.3单/双甲基化增加，以及肝脏中H3.2磷酸化在变态高峰期暂时升高。这是首次对TH介导的两栖动物变态过程中组蛋白异构体、变异体及PTMs进行的非靶向分析。由于TH信号通路的保守性，本研究拓宽了我们对所有组蛋白家族协调变化的认知，这些变化指导组织特异性转变，对两栖动物及其他脊椎动物的TH驱动发育至关重要。Introduction甲状腺激素（THs）是几乎所有脊椎动物器官系统及其全生命周期（尤其是发育阶段）的关键代谢调节因子。两栖动物变态是TH依赖性胚胎后发育过程的典型范例，水生蝌蚪在此过程中转变为（半）陆地青蛙。变态需要协调的全身重塑，包括但不限于幼虫红细胞（RBCs）被成虫红细胞替代、肝脏的广泛代谢重编程以及蝌蚪尾鳍的吸收。这些多样化组织命运及底层细胞机制的协调，部分通过严格控制的组织特异性基因表达变化来实现。关于TH如何引发这些多样化、组织特异性的基因表达变化，目前知之甚少。变态前蝌蚪处于功能无甲状腺状态。在变态前期，蝌蚪甲状腺主要产生L-甲状腺素（T4），其可在靶细胞中通过脱碘酶活性转化为3,5,3’-三碘甲状腺原氨酸（T3）。TH水平在变态高峰期达到峰值，随后在幼蛙阶段降至超基础水平。在细胞核内，THs通过结合甲状腺激素受体（TRs）（包括TRα和TRβ）调控基因表达，这些受体组成型结合于TH调控基因调控区的TH反应元件（TREs）上。未结合TH时，TRs与转录共抑制复合物结合；TH结合后引发TR构象变化，使共抑制复合物转换为转录共激活复合物。这些共激活/共抑制复合物包含染色质重塑蛋白和组蛋白修饰酶，表明表观遗传过程与TH作用直接相关。表观遗传过程在不改变DNA序列的情况下调控基因表达。DNA通过反复缠绕组蛋白八聚体形成染色质，从而在细胞核内有序压缩。染色质是由基因组DNA、组蛋白及其他染色质相关蛋白组成的动态可塑结构，是DNA可及性的关键功能组织者。因此，染色质结构调控对DNA复制、修复、基因转录及沉默等关键细胞过程至关重要。染色质结构调节是表观遗传调控的主要机制。染色质的基本重复单元是核小体，其DNA缠绕于由两个H2A、H2B、H3和H4核心组蛋白单体组成的八聚体上。进出核小体的连接DNA还可被连接组蛋白（如H1或H5）或其他连接DNA结合蛋白结合。大部分组蛋白翻译发生在细胞S期，以包装新复制的DNA。这些“复制依赖性”组蛋白通常是同形异构体，与典型异构体序列差异有限。核小体组成的变化可改变染色质构象，进而影响DNA可及性和利用，最终调控基因表达。染色质组织改变的方式之一包括在核小体中掺入组蛋白变异体以替代典型组蛋白，该过程可不依赖复制发生。组蛋白变异体通常是非等位基因异形组蛋白，其序列与典型形式显著不同。组蛋白翻译后修饰（PTMs）也可直接通过影响邻近电荷或间接通过招募染色质修饰复合物来改变染色质结构。越来越多的修饰被识别，其中甲基化、乙酰化和磷酸化是研究最深入的几种。还有其他多种机制可改变染色质结构，它们可协同作用以促进或阻碍其他核因子及复合物（包括TH调控相关复合物）的结合。发育过程中染色质调控的重要性已得到充分证实。THs的转录调控涉及TRs结合的TH响应基因相关染色质重塑。在非洲爪蟾中，T3处理与变态前蝌蚪肠道和尾鳍中H4乙酰化水平增加相关，并与肠道TH调控基因上H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）减少相关。此外，T3处理导致牛蛙肝脏中TH响应基因的H3K36me2和H3K36me3增加。这些发现表明TH作用可能涉及组蛋白组成的组织特异性变化。需要更多研究来探索TH介导变态过程中不同命运组织中组蛋白动态的潜在变化。破译TH介导变态过程中染色质结合组蛋白异构体、变异体及PTMs的变化，可揭示这一敏感早期发育阶段关键的表观遗传机制。TH信号机制在脊椎动物中高度保守。鉴于两栖动物的TH依赖性变态与TH介导的哺乳动物围产期发育平行，该领域的进一步研究有助于扩展我们对协调性和组织特异性TH介导发育的理解。两栖动物是研究TH依赖性发育的理想模型，因为如美洲牛蛙等物种的变态始于功能无甲状腺的变态前蝌蚪的TH诱导。相比之下，哺乳动物围产期发育的类似研究则受母体TH存在的干扰。本研究使用串联质谱（MS/MS）检测美洲牛蛙血液、肝脏和尾鳍在自然TH介导变态过程中的组蛋白全局变化及相关推断PTMs。美洲牛蛙是研究TH作用的理想动物模型：蝌蚪体型较大，无需合并多个个体组织；其广泛（入侵）种群分布允许使用野生捕获动物以捕捉自然变异；牛蛙变态更接近哺乳动物发育，因为水生蝌蚪发展为陆地青蛙，而常用爪蟾物种在幼体和成体阶段仍保持半水生性。研究从变态前和变态高峰期蝌蚪的血液、肝脏和尾鳍以及新变态幼蛙（<1岁）的血液和肝脏中分离二倍体细胞核。通过酸提取富集碱性蛋白（包括组蛋白和染色质相关蛋白），蛋白质提取物在胰蛋白酶消化前经三甲基乙酸酐（tma）化学修饰。MS/MS具有足够分辨率区分甚至单氨基酸序列差异的肽段，从而可识别具有高序列相似性的组蛋白异构体。此外，MS/MS可通过识别与已知PTMs质量对应的质量偏移来检测肽段上的潜在PTMs。该分辨率可识别牛蛙变态过程中组蛋白异构体丰度及推定PTMs的组织特异性变化。据我们所知，这是首次对自然发生两栖动物变态过程中组织特异性组蛋白变化的全面非靶向MS/MS分析。Materials and methods所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich（加拿大安大略省奥克维尔），除非另有说明。Results and Discussion据我们所知，本研究是首次对自然发生TH依赖性两栖动物变态过程中组蛋白变化进行组织特异性非靶向表征。观察到的基于组蛋白的变化提示了与TH调控关键早期发育期相交的潜在表观遗传机制靶点。Conclusion本研究首次全面表征了自然发生、TH依赖性两栖动物变态过程中多个组织内组蛋白组成的全局变化。我们识别了在这一胚胎后发育期显著改变的组蛋白变异体和推定PTMs，提供了与TH活性可能相关的组蛋白丰度和PTMs新颖且潜在协调变化的路线图。CRediT authorship contribution statementYassene Mohammed：评审编辑、方法学、形式分析。Haley Kuecks-Winger：评审编辑、原稿撰写、方法学、研究实施、形式分析、数据管理、概念化。Anita A. Thambirajah：评审编辑、监督、方法学、形式分析、概念化。Caren Helbing：评审编辑、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取、形式分析。Data availability血液、肝脏和尾鳍的PSM结果文件见补充文件S1、S2和S3。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE（Perez-Riverol et al., 2025）合作存储库提交至ProteomeXchange Consortium，数据集标识符为PXD065774。Acknowledgements作者感谢维多利亚大学基因组BC蛋白质组学中心 staff 进行MS/MS分析。工作由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金（RGPIN-2018-03816）资助CCH。数据分析部分由加拿大数字研究联盟支持CCH。图形摘要通过BioRender创建（Kuecks-Winger, H. (2025) https://BioRender.com/0ysbbbt）。
