靶向B7-H3逆转CAR-T细胞耗竭：卵巢癌中脂质代谢介导的免疫治疗新策略

本研究针对CAR-T细胞在实体瘤免疫抑制微环境中的功能性耗竭难题，聚焦卵巢癌中MSLN靶向CAR-T疗法。通过LC-MS/MS筛选发现肿瘤源性氧化脂质12-HETE通过GPR31依赖性脂质过氧化驱动T细胞耗竭，并揭示B7-H3通过抑制FOXO3调控12-LOX/12-HETE轴的上游作用。利用高通量虚拟筛选获得新型B7-H3抑制剂HI-TOPK-032，证实其可协同CAR-T疗法降低耗竭标志物(PD-1+TIM-3+)，增强细胞因子多功能性。该研究为MSLN阳性实体瘤提供了精准联合治疗新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中取得显著成效，但其在实体瘤治疗中仍面临巨大挑战。卵巢癌作为常见的妇科恶性肿瘤，因其独特的"亲脂性"微环境特征，成为研究CAR-T细胞耗竭机制的理想模型。肿瘤微环境（TME）中的代谢重编程和免疫抑制因子被认为是导致CAR-T细胞功能耗竭的关键因素，然而脂质代谢产物如何影响CAR-T细胞功能的具体机制尚不明确。

针对这一科学问题，北京妇产医院团队在《eBioMedicine》发表了创新性研究成果。研究人员通过构建靶向间皮素（MSLN）的CAR-T细胞模型，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，发现卵巢癌微环境中12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）的异常积累是驱动CAR-T细胞耗竭的关键代谢检查点。进一步机制研究表明，B7-H3通过抑制转录因子FOXO3调控12-脂氧合酶（12-LOX）表达，从而影响12-HETE水平。通过基于结构的高通量虚拟筛选，团队成功鉴定出首个B7-H3小分子抑制剂HI-TOPK-032，该化合物能够显著逆转CAR-T细胞耗竭表型，并与抗PD-1疗法产生协同抗肿瘤效应。

研究采用多组学技术手段，包括：1）建立MSLN-CAR-T细胞与卵巢癌细胞共培养体系评估细胞耗竭状态；2）利用LC-MS/MS进行肿瘤组织脂质组学分析；3）采用RNA测序技术解析B7-H3敲除后的转录组变化；4）通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的表型和功能；5）构建患者来源异种移植（PDX）模型验证治疗策略（样本来源于北京妇产医院2020-2022年手术采集的20例高级别浆液性腺癌组织）；6）应用基于结构的虚拟筛选技术发现B7-H3抑制剂。

研究结果部分揭示了一系列重要发现：

^{营养条件模拟肿瘤微环境抑制CAR-T细胞耗竭}

通过建立MSLN-CAR-T细胞与卵巢癌细胞的共培养系统，发现肿瘤细胞条件培养基可显著抑制CAR-T细胞因子分泌功能，而不影响细胞活力。在体内模型中，肿瘤浸润CAR-T细胞相比外周血CAR-T细胞表现出增殖能力下降和耗竭标志物PD-1表达升高。

^{12-HETE由肿瘤细胞分泌并在卵巢癌中积累}

组织学分析显示卵巢癌组织中氧化磷脂水平显著升高。LC-MS/MS检测发现12-HETE在癌组织中特异性富集，其水平在肿瘤间质液中达到4 ng/mL，显著高于血浆浓度。12-LOX在卵巢癌细胞系中高表达，与12-HETE分泌水平正相关。

^{12-HETE促进CAR-T细胞耗竭}

剂量实验证实12-HETE以浓度依赖方式抑制CAR-T细胞因子产生。使用12-LOX抑制剂CAY10698处理肿瘤细胞后，其条件培养基对CAR-T细胞的抑制作用显著减弱。相反，过表达12-LOX的肿瘤细胞可增强对CAR-T细胞的抑制效应。

^{GPR31+ TILs处于更深度耗竭状态}

流式分析显示人卵巢癌组织中PD-1⁺TIM-3⁺ CD8⁺ TILs高表达GPR31。在ID-8小鼠卵巢癌模型中，晚期肿瘤（28天）的CD8⁺ TILs中GPR31表达显著高于早期（14天），且终末耗竭亚群（PD-1⁺TIM-3⁺）GPR31表达最高。

^{GPR31促进T细胞功能失调}

GPR31基因敲除小鼠肿瘤生长减缓，CD8⁺ TILs产生更多IFN-γ和颗粒酶B，PD-1和TIM-3表达降低。在人体细胞实验中，敲低GPR31可逆转12-HETE对CAR-T细胞的抑制作用，恢复细胞因子分泌和增殖能力。

^{12-HETE通过GPR31依赖性方式诱导CAR-T细胞脂质过氧化}

12-HETE处理可剂量依赖性增加CAR-T细胞脂质过氧化水平（MDA升高，GSH/GSSG比率降低）。GPR31敲低可逆转这一效应。抗氧化剂维生素E处理可恢复12-HETE抑制的T细胞功能。

^{B7-H3表达与12-LOX上调及FOXO3参与相关}

siRNA筛选发现B7-H3敲低可显著降低12-LOX表达。超分辨率显微镜显示B7-H3在卵巢癌细胞核、细胞膜和胞质中均有分布。RNA测序表明B7-H3敲除后FOXO信号通路显著富集。B7-H3过表达降低FOXO3蛋白水平，而激活FOXO3可抑制12-LOX表达。

^{小分子化合物HI-TOPK-032体外抑制B7-H3表达和CAR-T细胞耗竭}

高通量虚拟筛选获得HI-TOPK-032，其可与B7-H3胞外IgV结构域形成5个氢键。该化合物剂量依赖性抑制B7-H3蛋白表达，降低12-HETE分泌和12-LOX mRNA水平。在CAR-T细胞反复抗原刺激模型中，HI-TOPK-032处理可减少PD-1⁺TIM-3⁺ TCF1^-耗竭T细胞比例，增强细胞因子多功能性。

^{HI-TOPK-032体内促进CAR-T细胞抗肿瘤效应}

在OVCAR3-ML荷瘤NSG小鼠模型中，HI-TOPK-032（10-20 mg/kg）联合CAR-T治疗显著抑制肿瘤生长，延长生存期。流式分析显示联合治疗组肿瘤内CD8⁺ T细胞数量增加，Ki-67⁺增殖细胞增多，IFN-γ⁺TNF-α⁺多功能T细胞比例升高，PD-1表达降低。在B7-H3/12-LOX高表达的PDX模型中，HI-TOPK-032疗效尤为显著。

^{HI-TOPK-032与免疫检查点阻断（ICB）联合促进CAR-T细胞浸润并提高免疫治疗效果}

HI-TOPK-032（20 mg/kg）与抗PD-1抗体（100 mg/kg）联合治疗显示协同抗肿瘤效果，60%小鼠生存期超过100天。联合治疗组肿瘤内CD8⁺ T细胞数量和功能显著增强，细胞因子产生增加。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次揭示了卵巢癌微环境中12-HETE通过GPR31介导的脂质过氧化驱动CAR-T细胞耗竭的代谢机制。B7-H3作为上游调控分子，通过抑制FOXO3增加12-LOX表达和12-HETE产生。HI-TOPK-032作为首个B7-H3小分子抑制剂，可有效逆转CAR-T细胞耗竭，并与免疫检查点阻断产生协同效应。这些发现不仅为理解肿瘤代谢与免疫细胞互作提供了新视角，也为MSLN阳性实体瘤的精准免疫治疗提供了创新性联合策略。研究局限性包括对12-HETE影响其他免疫细胞群体的探讨不足，以及PDX模型样本量有限等。未来研究需要进一步验证HI-TOPK-032的临床转化潜力及其在多种实体瘤治疗中的普适性价值。