从干旱红树林沉积物分离的Bacillus sp. SW14通过全基因组分析与温室验证显著促进番茄生长

本研究从干旱红树林沉积物中分离出一株新型植物根际促生菌（PGPB）Bacillus sp. SW14，通过全基因组测序揭示了其携带的多种PGP相关基因（如nifSUM、pqq、trpABCDEFS等），并经由温室实验证实该菌株能显著提升番茄的发芽率、叶片数、叶面积、叶干重、SPAD值及光合色素含量，为应对气候变化下干旱农业生态系统的作物生长挑战提供了具有应用潜力的微生物资源。

　　

引言

红树林不仅生长于热带和亚热带环境，也分布于干旱地区（南北纬20至33度之间），例如中东、墨西哥加利福尼亚湾、非洲亚热带地区、西澳大利亚和西南非。这些干旱红树林适应高温、低降水和高蒸发的严酷条件。尽管湿度低、盐浓度高，这些干旱红树林仍支持着多样的微生物群落，包括耐盐和耐热的菌株。研究表明，从干旱红树林沉积物和根际分离的细菌具有多种植物生长促进（PGP）特性。这些细菌执行着关键功能，如固氮、磷酸盐（P）和钾（K）的溶解，以及产生植物激素如吲哚-3-乙酸（IAA）。例如，从白骨壤（Avicennia marina）根际沉积物中分离的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和赤红球菌（Kocuria rhizophila）能够溶解磷酸盐、产生IAA和氨。类似地，从红树林沉积物中分离的红球菌属（Rhodococcus sp）和节杆菌属（Arthrobacter sp）也表现出较高的磷酸盐溶解能力。

除了营养动员，来自红树林环境的PGPB还能抵抗和去除重金属，从而减轻植物胁迫并改善植物生长，尤其是在干旱环境中，干旱是影响植物生长和生产力的重要因素。红树林相关PGPB的这些适应性特性在气候变化下干旱地区的扩张中尤为重要。由于气候变化，到2050年，超过50%的耕地可能面临与植物生长相关的挑战。地球表面约40%已经是干旱地区——包括干旱、半干旱和极端干旱土地——并且这一比例预计会因气候变化而进一步扩大。这些地区受到恶劣环境条件的严重影响，如水资源短缺、高太阳辐射、温度波动、土壤盐渍化和营养缺乏，所有这些都显著影响植物的生长和存活。为了在这些环境条件下实现所需的植物生长和作物生产水平，使用区域特异性微生物菌株作为接种剂是化学肥料的一种有前景的替代方案。例如，来自干旱地区的两株PGPB——蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和白色芽孢杆菌（Bacillus albus）——具有独特的特性，使它们能够在极端环境中茁壮成长，包括低营养可用性、高盐度、强太阳辐射和干旱。我们最近的研究进一步证明了这种潜力：对从干旱红树林分离的Bacillus sp. SW7进行的基因组特征分析和温室试验显示，其具有多个PGP相关基因并能增强番茄植株的生长。

在全球范围内，PGPB被报道能促进许多作物的生长和产量，如玉米、小麦和番茄。番茄是全球使用最广泛的蔬菜之一。提高番茄的产量、保护和品质需要非化学替代品。使用基于PGP芽孢杆菌的生物肥料的研究表明，它们能提高番茄产量和果实品质。几种芽孢杆菌属物种，包括地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、Bacillus sp. SW7和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），已成功定殖番茄根际并增强生长和产量。

在本研究中，我们对从阿拉伯联合酋长国（UAE）乌姆盖万（Umm Al Quwain）的红树林沉积物（25°32’06.0”N, 55°37’50.9”E）中分离的Bacillus sp. SW14进行了基因组表征。Bacillus sp. SW14拥有多个PGP以及耐热和耐盐胁迫基因等。然而，该菌株的基因组特征和田间评估此前尚未进行。因此，我们旨在（i）使用全基因组测序对先前分离的Bacillus sp. SW14进行表征，以鉴定负责PGP性状的基因簇；（ii）进行泛基因组和系统发育基因组分析，以了解Bacillus sp. SW14的分类学特性；以及（iii）评估Bacillus sp. SW14对番茄（Solanum lycopersicum）种子萌发和生长在温室实验中的影响。

材料与方法

种子准备、表面包衣和萌发实验

使用浮选试验评估番茄种子活力。番茄种子（Solanum lycopersicum）的收集和包衣方法如先前所述。简而言之，使用5%次氯酸钠溶液对种子进行表面消毒1分钟，然后用70%乙醇冲洗1分钟。随后用无菌蒸馏水冲洗种子5次，并在层流罩中风干。将Bacillus sp. SW14接种在Luria Bertani（LB）肉汤中，于30°C培养8小时。当OD₆₀₀ nm = 0.8时，在10,000 rpm下离心5分钟分离细菌沉淀，并按照先前描述的方法将细菌细胞包被到种子上。包衣后，将种子风干并放置在培养皿中的无菌滤纸上，每皿30粒种子，此方法用于测试萌发和温室试验。所有处理均设三个重复，用蒸馏水处理的种子作为对照。培养皿中的萌发率在25°C黑暗条件下培养14天后测量。测量总幼苗长度以及鲜重和干重。

根据以下公式计算萌发率：萌发率（%）=（萌发种子数/总种子数）× 100%

温室试验

种子包衣后立即开始播种准备。我们在每个育苗盘中准备了50个播种穴。在开始播种过程之前，根据处理对盘进行标记，并放置在阿拉伯联合酋长国迪拜国际生物盐农业中心（ICBA）的温室中。温室条件与先前描述相似。使用无菌镊子，将每粒种子拾起并种植在每个穴中，在土壤中制造小凹坑。然后我们灌溉苗盘并让其萌发。我们每天浇水3次以保持土壤湿润，这是种子萌发的最佳条件。随着幼苗开始生长，灌溉量略有增加。

在温室中，监测幼苗生长4周并收集数据后，将形态良好的幼苗直接从育苗盘移栽到温室中，在那里它们再接受近持续灌溉4周直至成熟。温室条件保持与先前描述相似。温室条件没有严格控；而是由当天的天气、温度和湿度决定。我们使用saganizer garden hand在土壤中制造微小穿孔，随后补充比例为1:3的NPK肥料和有机腐殖质混合物。这一做法旨在增强萌发和随后的幼苗生长，并促进在温室田间试验环境中移植幼苗的最佳发育。如先前所述，幼苗每天浇水两次，一次在早上，一次在晚上，持续数周。

评估Bacillus sp. SW14对植物生理参数的影响

进行SPAD分析以评估完全成熟叶片的营养状况，每个植株三个重复，每组五个植株，使用502P叶绿素计（Konica Minolta, Inc., Tokyo, Japan）。叶面积指数（LAI）通过测量叶长（L）和叶宽（W）并应用公式（L × W × 0.75）确定，其中0.75表示叶片补偿因子。收集每株植物三片叶子，并通过测定鲜重（Fw）和干重（Dw）来评估水分含量。干重（Dw）在104°C孵育两小时并在80°C孵育72小时后测量。水分含量（%）使用公式计算：(Fw?Dw)/Fw?100。叶片密度使用重量法测定，涉及将叶片质量除以叶面积，通常以克每平方米（g/m2）表示。对于叶绿素分析，收集每株植物三片叶子并在-20°C冷冻。将0.2克冷冻叶片样品与4毫升二甲基亚砜混合24小时，随后在波长663 nm、645 nm和470 nm处测量吸光度。使用报道的方程计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素（叶绿素a + b）和类胡萝卜素含量。使用Student’s t检验进行对照和接种样品之间的统计比较，显著性确定为P < 0.05。

DNA提取和全基因组表征

我们使用Qiagen power soil DNA试剂盒按照制造商的方案进行基因组DNA分离。使用牛津纳米孔技术（ONT）和短读长（MGI）进行全基因组测序。对于ONT，使用连接测序试剂盒V14（SQK-LSK114）和PCR-96扩展试剂盒构建文库，并在MinION MKC140中使用R10.4.1流动池（内部）进行测序。生成的pod5_pass文件使用高精度碱基识别（DAN-400bps -5kHz）进行碱基识别，从而从序列中去除条形码和ONT接头，产生修剪后的序列。对于MGI测序，按照我们先前的研究构建文库，并使用MGI测序仪（150 bp x 2双端）在BGI-中国进行测序。使用FastQC V 0.12.1工具评估MGI原始读段质量，并使用Trimmomatic（V 0.39）修剪以去除低质量读段（Phred分数低于20），参数如下：ILLUMINACLIP: TruSeq3-PE.fa:2:30:10:2:True LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:36。我们采用混合基因组组装，使用Unicycler（V 0.5.1）利用修剪后的ONT长读段和MGI短读段，使用标准参数。使用Quast 5.2.0、CheckM和Busco（版本4.1.4，使用bacteria_odb10）评估组装质量。随后使用Prokka V 1.14.6和prodigal对组装进行注释。此外，我们还使用开放的基于网络的平台PLaBase-PGPT-Pred来识别PGP基因。另外，我们使用PLaBAse-PIFAR来识别植物-细菌相互作用基因及其机制。

组装的基因组的Prokka格式蛋白质（氨基酸）序列用于使用COG分类器进行功能注释，我们使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库和blastkoala来识别通路。组装的基因组连同预测的基因和非编码tRNA序列用于使用Circos版本0.69-6创建环状基因组图谱。ONT和MGI读段以及组装均存入国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，登录号为PRJNA1068844，Biosample为SAMN46135429（SRR31926110和SRR31926111），组装基因组登录号为JBLKRW000000000。

泛基因组和系统发育基因组分析

我们使用anvio（V8）进行了泛基因组和系统发育基因组分析，为此下载了系统发育上最接近的基因组（基于Type Strain服务器），以及在半干旱和极端干旱地区报道为PGPB的芽孢杆菌属物种。总共使用了15个密切相关的芽孢杆菌基因组。泛基因组构建遵循anvio（V8）细菌泛基因组学工作流程。详细来说，基因组通过以下脚本处理：anvi-script-reformat-fasta（将fasta转换为anvio可读格式），然后使用anvi-gen-contigs-database创建数据库，随后合并，进一步用于使用Prodigal v2.6.33识别开放阅读框。然后，我们使用pyANI（anvi-compute-genome-similarity）计算基因组之间的相似性。我们使用anvi-pan-genome计算泛基因组，并使用anvi-display-pan可视化。使用Anvi’o创建带有prokka注释的环状Bacillus sp. SW14基因组，该软件利用MUSCLE进行序列比对。使用anvi-import-functions导入注释，然后使用anvi-profile进行分析，并使用anvi-interactive可视化。我们进行了比较分析，以识别Bacillus sp. SW14与其最接近的亲缘种Bacillus vallismortis DV1 F-3之间共享和独特的基因。使用OrthoVenn3识别直系同源基因簇，以其Prokka注释基因组的氨基酸序列作为输入。该分析使我们能够确定SW14菌株的独特基因组内容。

结果

种子萌发和温室实验

我们观察到用SW14菌株处理的番茄种子的萌发率与对照组相比略有改善，但差异无统计学意义。此外，温室试验揭示了各种参数的改善，表明SW14菌株对番茄植株生长和发育产生了积极影响。值得注意的是，在叶片干重（P = 0.047）、叶面积（P = 0.0132）、类胡萝卜素（P = 0.0029）以及总叶绿素与类胡萝卜素比率（P = 0.0101）方面观察到显著差异。其他参数，如SPAD值，也从对照组增加到SW14菌株接种组。每株植物的叶片数和茎高在SW14菌株接种组中也比对照组有所增加，表明叶片发育增强。然而，在SW14接种和对照植物之间，叶绿素a和b水平未观察到显著差异。总体而言，结果表明与未处理的对照植物相比，SW14菌株显著改善了植物生长性状和叶绿素含量。

基因组特征

SW14菌株的组装基因组大小为4.25 Mb，完整性100%，污染率0.02%，G+C含量为43.72%。Busco分析也证实了基因组的完整性，识别出124个无重复的单拷贝基因。SW14菌株基因组编码4,401个CDS、86个tRNA、23个rRNA和68个重复区域。在预测的蛋白质中，3,618个被分配到具有功能分配的蛋白质，而783个被分类为假设蛋白质。此外，1,058个蛋白质被分配了酶委员会（EC）编号，880个蛋白质被注释了GO术语，773个蛋白质与通路功能相关联。总共80.25%的基因被分配到COG功能类别。其中，294个基因与碳水化合物转运和代谢相关，289个与氨基酸转运和代谢相关，277个与转录相关，227个与翻译、核糖体结构和生物发生相关。关于分配到COG类别的蛋白质的详细信息在补充文件中。

基于看家基因的系统发育分析

基于16S rRNA的系统发育测试显示，SW14菌株与Bacillus inaquosorum KCTC 13429和Bacillus cabrialesii亲缘关系更近。然而，基于看家基因gyrB，SW14菌株与多个未分类的芽孢杆菌物种密切关联，这表明SW14代表一个新菌株。

全基因组系统发育、平均核苷酸同一性和泛基因组学

Type Strain服务器将SW14菌株识别为一个潜在的新物种，因为数据库中无可用的密切相关的基因组。在系统发育树中，SW14菌株形成了一个独立的分支，与其他芽孢杆菌物种分开，尽管它与Bacillus vallismortis DV1 F-3菌株亲缘关系最近。基于pyANI分析，SW14菌株的基因组与Bacillus vallismortis DV1 F-3仅显示93.58%的相似性，随后与芽孢杆菌物种（包括Bacillus inaquosorum strain A65-1、Bacillus inaquosorum strain KCTC 13429、Bacillus rugosus SPB7、Bacillus rugosus strain A78–1和Bacillus subtilis subsp spizizenii TU-B-10）有93.3%的相似性。此外，SW14菌株的基因组与其他芽孢杆菌物种仅共享71-73%的同源性。对Bacillus sp. SW14及其最接近的亲缘种Bacillus vallismortis DV1 F-3的比较揭示了我们的菌株具有独特的基因组内容。Bacillus sp. SW14含有36个独特的簇，包含791个单例基因，而Bacillus vallismortis DV1 F-3有27个独特的簇，包含703个单例，两个菌株共享3,250个基因簇。这些独特的基因可能有助于在Bacillus sp. SW14中观察到的独特PGP性状和环境适应性。

植物生长促进性状相关基因

基于PGPT_pred分析，我们鉴定了几种与固氮相关的PGP基因，如nifSUM，而使用Prokka注释仅检测到nifS。Prokka注释鉴定出SW14菌株的基因组包含参与反硝化和硝酸盐还原的基因（narGTHX、nasA、nfrA、nirC和norQRM），而PGPT_pred识别出更多数量的基因以及硝酸盐和亚硝酸盐转运（nirC）、尿素代谢和转运（ureABC）的基因也在两种注释中被识别；此外，参与尿素转运的基因如urtABCDE使用PGPT_pred被识别。基于PGPT_pred鉴定了磷酸盐溶解代谢（包括转运）基因，如pqq、PhoADEHPRU和pstABCS。然而，仅通过Prokka分析识别了phoABDR和pstABS。同样，使用PGPT_pred识别了钾溶解基因，包括kch/mthK、trkAGH和ktrAB。铁载体相关基因（dhbABCEF）及其支持的转运机制基因如yusV、yfhAZ、yflTY和yfiZ也存在于SW14基因组中，还识别了与铁转运相关的基因（fetBD和feuABC）。两种注释都识别了负责IAA合成的色氨酸前体基因（trpABCDEFS）。然而，直接的IAA产生基因，如IpdC和dhaS，缺失。有趣的是，基于PGPT_pred，识别了IAA通路基因如iaaT/yedL/ysnE和yhcx。

环境胁迫和生物勘探相关基因

除了PGP基因外，还识别了主要的热休克蛋白（GrpE、dnaJ、K和groL、S）、耐旱基因如yciG和yxaL（基于PGPT_pred）和耐盐基因（RelA）。鉴定了分泌杀菌化合物（如奥拉奎宁、杆菌烯、利福霉素、杆菌素、头孢菌素、环丝氨酸、诺卡霉素、灵菌红素、亚精胺、表面活性素、毒黄素）的基因性状（acpP、acpK、baeDHLSEGMRCN、cvpA、rseP、ybhFS、cah、dcsA、mbtH、fabDI、paiA、speBEG、srfAA、srfab、srfAC、ribD和toxF）和杀真菌化合物生物合成基因如bpsAB、asm14,17、tktAB、ituB、cbpS、nagZ、ppsABCD、ntdABC和toxF在SW14基因组中被识别。

讨论

芽孢杆菌属物种因其促进植物生长和抑制植物病原体发展的能力而被广泛认可，使其成为生物农药和生物肥料的有前景的替代品。研究表明，近一半的商业化生物防治细菌产品基于芽孢杆菌菌株。为了评估Bacillus sp. SW14的植物生长促进潜力，我们检查了其对番茄表型和生理性状的影响，以及 underlying 这些功能的基因组决定因素。我们的研究结果表明，Bacillus sp. SW14 增强了植物生长性状，如种子萌发、植物叶片数、叶片水分含量、叶面积指数、茎高、SPAD和叶绿素含量。进一步的基因组分析揭示了该菌株中的多个PGP和胁迫相关基因，使其成为干旱环境中潜在有用的PGP细菌。系统发育和泛基因组分析显示Bacillus sp. SW14是一个新菌株，与Bacillus vallismortis亲缘关系最近。

Bacillus sp. SW14改善了番茄种子萌发和植物生长性状

我们发现SW14菌株显著增强了番茄种子萌发和生长。这种增强反映在各种生理性状中，包括SPAD、叶片数、叶面积、叶片鲜重、叶片干重、叶片水分含量、茎高和叶绿素含量。我们的发现与先前的研究一致，显示红树林沉积物相关细菌Bacillus sp. SW7菌株显著增强了番茄植株的生长。其他几种芽孢杆菌属物种，如Bacillus licheniformis、Bacillus cereus、Bacillus safensis和其他Bacillus sp.，已被报道在干旱和盐渍环境中改善种子萌发。在我们的结果中，与对照组相比，SW14菌株接种组的种子萌发率增加。由于PGPB能够定殖种子并产生分解种皮的裂解酶，促进了细菌进入种子。此外，PGPB合成调节种子萌发的植物激素。

此外，PGPB产生生物分子，如抗生素、铁载体和氰化氢，这与我们早期的研究一致，显示SW14菌株产生IAA（8.55 ppm）、铁载体（7.67 ± 2.31）和氰化氢。此外，基因组分析显示了负责IAA合成的色氨酸前体基因和铁载体基因的存在。我们的结果与其他PGPB菌株一致，如Acinetobacter radioresistens KBENdo3P1和Bacillus sp. SW7，已显示具有多种PGP性状。

在温室条件下，接种Bacillus sp. SW14菌株的番茄植株显示出增强的植物生长，特别是在叶表面、叶片干质量以及光合色素，包括类胡萝卜素和总叶绿素与类胡萝卜素比率方面。这与其他研究一致，其中Bacillus sp. 菌株分别显著改善了盐胁迫下各种作物的植物生长性状。光合色素的增加归因于营养和水分的吸收增加，以及PGPB产生胞外多糖和磷酸盐溶解性状。我们的观察与其他研究一致，即枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌、肠杆菌属和荧光假单胞菌分别增加了番茄和小麦的叶绿素含量。此外，一些芽孢杆菌属物种在干旱条件下通过增加调节叶绿体的镁和钙来增强光合活性。此外，Katsenios等人证明地衣芽孢杆菌处理增加了番茄干重，这与我们当前的研究相似，其中SW14菌株接种植物的叶片干质量高于对照植物。在SW14菌株接种的番茄植株中观察到的这种增强生长归因于SW14菌株中存在的植物生长促进基因。总之，这些发现表明，接种特定的芽孢杆菌属物种可以是一种有效的方法，以改善番茄种子萌发和整体植物生长性状，特别是在具有挑战性的干旱环境中。

SW14中的植物生长促进基因

SW14菌株包括固氮能力，这对植物生长至关重要，基因组证实了固氮基因如nifSUM的存在，这些基因参与Fe-S簇组装，为氮酶活化所必需。几种PGP芽孢杆菌物种，如Bacillus halotolerant和Bacillus amyloliquefaciens，已知仅具有nifS和nifU基因。尽管在组装的基因组中未识别出关键的固氮基因，但存在参与反硝化、硝酸盐/亚硝酸盐转运、氮调节、氨生产和尿素代谢的基因，反映了该菌株在氮代谢中的作用。除了关键固氮基因外，在Bacillus altitudinis FD48和Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum strain Fito_F321中也观察到了类似的基因组结构。我们还在基因组中识别了吡咯喹啉醌（pqq）基因，该基因参与P的溶解以及完整的同化和转运基因集被识别。大多数报道的PGP芽孢杆菌物种具有P转运或同化。为了克服渗透胁迫，植物需要钾，PGP细菌通过溶解和转运K来帮助，这有助于植物减轻渗透胁迫。我们在SW14基因组中识别了负责K溶解、吸收和转运的基因，与其他报道的PGP芽孢杆菌物种一致。此外，间接支持机制，如铁载体生产，在SW14基因组中也很明显。识别了负责铁吸收和bacillibactin生物合成的基因簇，这些与其他PGP芽孢杆菌物种相似，如Bacillus altitudinis T5S-T4、B. subtilis MBB3B9、B. altitudinis FD48，这些基因在铁获取和促进植物生长中起关键作用。

由PGP细菌产生的植物激素，如IAA、赤霉素和细胞分裂素，在植物生长促进中具有重要作用。从根际分离的细菌大多能够通过五种不同的途径从色氨酸合成IAA。尽管SW14菌株基因组没有直接的IAA产生基因，如ipdC和iaaH，但它包含完整的基因集，如iaaT和yhcX以及色氨酸途径基因（trpABCDEFS），这证实了SW14菌株的体外IAA生产。类似地，在其他芽孢杆菌属物种中也注意到了仅存在色氨酸基因（IAA的前体），如Bacillus sp. IHBT-705、B. altitudinis 19RS3和B. altitudinis T5S-T4。

结论

本研究展示了多功能Bacillus sp. strain SW14作为PGPB的完整基因组序列和温室评估。体外筛选结果通过基因组分析得到验证，支持SW14菌株作为PGPB。该菌株携带许多与番茄中PGP性状相关的标志性基因，包括吲哚-3-乙酸（IAA）生产、铁载体生产、氨（NH₃）生产以及磷酸盐和钾溶解。这些遗传属性突出了Bacillus sp. SW14增强番茄植株生长的能力。此外，基因组包含耐热和耐盐基因，表明该菌株非常适合干旱环境。此外，温室实验证明Bacillus sp. SW14增强了植物生长参数，如SPAD、叶片干质量、茎高、叶绿素a和b、类胡萝卜素以及总叶绿素与类胡萝卜素比率。更全面的比较分析可能会提供更多关于PGP在温室条件下对其真核宿主作用模式的见解。然而，需要未来的研究来评估Bacillus sp. SW14在较少控制的田间环境下的分子机制，以验证其在干旱农业环境中的功效。